液相色谱的方法开发-梯度方法详解.ppt

液相色谱的方法开发 （二）梯度方法 梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱需再生 定量分析的重复性较低 梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度 梯度洗脱的可变参数 A及B液的成分和化学特性 梯度的陡度 梯度的变化形状 如不用梯度：分离不理想 梯度条件的优化 梯度曲线的变化∶凹线 梯度曲线的变化∶凸线 梯度平衡时间的影响（一） 梯度平衡时间的影响（二） 有机污染物的影响（一） 有机污染物的影响（二） 有机污染物的影响（三） 梯度方法开发实例 - 第一步 梯度方法开发实例 - 第二步 梯度方法开发实例 - 第三步 梯度方法开发实例 - 第四步 梯度方法开发实例 - 第五步 梯度方法开发实例 - 第六步 梯度方法开发实例 - 第七步 10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复 平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟 平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足。 50ml超纯水的有机物污染状态 “三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析 典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。 为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。 从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。