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实验一、真核细胞基因组DNA的提取-------外周血白细胞DNA的提取（NaI法） 一、实验目的： 了解和掌握从全血中提取DNA的方法等。 二、实验原理： 从全血制备白细胞DNA，采用NaI破核膜并有效解离DNA－蛋白质复物，使核酸处于易提取状态，再以氯仿/异戊醇抽提（蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程中泡沫产生），离心后DNA存在于上层水相中，以异丙醇沉淀及洗涤DNA，即获得白细胞DNA。用此法提取的DNA可用于Southern Blot、PCR的模板。 实验用品： 四、实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）200ul＋200ul 6M NaI振荡 2、加400ul氯仿- 异戊醇(体积比为24∶1)抽提5 min，13000rpm离心，10min 3、取上清，加200ul异丙醇，13000rpm离心，10min 4、弃上清，加 1ml 70％乙醇， 13000rpm离心，10min 5、弃上清，加20ulddH2O 五、实验结果及分析： 六、思考题： 采用NaI法提取外周血白细胞DNA的注意事项有哪些？ 如：标本必须新鲜；器材应高压灭菌；弃异丙醇时动作邀请，忌甩干等 实验二、核酸的检测 （琼脂糖凝胶电泳） 一、实验目的： 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理，掌握DNA电泳分析技术。 二、实验原理： DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的绝对值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成一种荧光络合物，在紫外照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。 实验用品： 实验步骤： 凝胶的制备→胶板的制备→加样→电泳→观察和拍照。 1、琼脂糖凝胶板的制备：1g琼脂糖＋50ml 电泳缓冲液，加热熔化均匀，冷却到60－70℃，加10ul EB 混合，倒入凝胶盒，厚3－5mm，插上点样梳，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液淹没过胶1－2mm为止。 2、加样：取出点样梳，10ul样品＋2ul（吸嘴一小滴）上样缓冲液，混合后取10ul加入点样孔。同时设立Marker（DNA分子量标准物） 3、电泳：60－90v，待溴酚蓝移至凝胶的2/3 距离时，停止电泳。 4、凝胶成像系统观察电泳结果。 五、实验结果及分析 1、画出电泳图。 2、简单说明分析。 实验三 质粒DNA的分离纯化-------碱裂解法提取质粒DNA 实验目的： 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理与方法，了解各种试剂的作用。 实验原理： 从细菌分离质粒DNA的方法都包含3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。碱变性法抽提质粒是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 将细菌悬浮于葡萄糖等渗液中，经EDTA、NaOH- SDS溶液处理，可破坏菌体细胞壁和细胞膜，使细胞崩解。 NaOH破坏核酸碱基对使氢键断裂，细菌染色体DNA和质粒DNA变性。 但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，所以当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 而线状染色体DNA片段难以复性，与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS-细胞膜复合物缠绕附着在细胞壁碎片上，冰浴后易沉淀，可离心除去。 通过氯仿/异戊醇等有机溶剂除去蛋白质，再用乙醇等有机溶剂沉淀DNA，即得纯化的质粒DNA。 实验用品： 试剂: 溶液Ｉ（葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl?维持pH?值、EDTA?抑制核酸酶） 50mmol/L葡萄糖 、25mmol/L?Tris．Cl(pH8.0) 、10mmol/LEDTA(pH8.0) 溶液Ⅱ（NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变性） 0.2mol/L?NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 、1%SDS 溶液Ⅲ（乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH?值） 5mol/Ｌ乙酸钾?60ml、冰乙酸?11.5ml、水?28.5ml 异丙醇、无水乙醇、蒸馏水 四、实验步骤： （一）细菌培养和收集 将含有质粒的Ecoli菌种接种在LB固体培养基（含50 μg/ml Amp）中，37oC培养12~24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含50μg/ml Amp）中，37 oC振荡培养约12小时至对数生长后期。 质粒D