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原生质体融合育种摘要原生质体融合育种克服了远缘杂交不亲和的障碍，可以提高重组频率，使得遗传物质的交换、传递更完整，成为微生物育种的一种重要方式。其过程包括原生质体制备和再生、原生质体融合以及融合体检出等步骤。在每个步骤中均要考虑到其应注意的因素，从而提高原生质体育种的效率，达到快速育种的目的。因原生质体融合育种的优势，其在多功能菌种选育、工程菌选育和工业生产育种等方面应用广泛。关键词原生质体制备 融合育种 原生质体再生 融合体检出引言传统的杂交育种具有一定的局限性，需要受到亲和力的影响，并且要求亲本有性的分化，而原生质体育种则克服了这些缺点。当细菌细胞壁被剥离，剩下由原生质膜包围的原生质部分称为原生质体。原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。[1]原生质体融合不受种属限制，能够完整的传递遗传物质，使得重组几率提高进而提高育种速度。[1-2]育种步骤可分为五大步骤：直接亲本及其遗传标记的选择、双亲本原生质体制备和再生、亲本原生质体诱导融合、融合重组体分离、遗传标记分析和测定。1.亲本遗传标记的选择进行原生质体融合的双亲本一般要携带遗传标记，以顺利地筛选到融合子。常用营养缺陷型、抗性、荧光染色、温度敏感性、孢子颜色、菌落形态等作为标记。其中营养缺陷型是常用而有效的选择手段。[3]2.原生质体制备制备原生质体是融合育种的前提，为了制备原生质体，需要将包围细胞的细胞壁去除掉。去壁的方法很多，主要有机械法、酶法和非酶法，现在使用较多的是酶法。[4]2.1酶法制备原生质体的条件（1）菌体年龄微生物的生理状态决定了原生质体的形成，而菌龄明显影响了原生质体的形成率，菌龄过长不利于释放原生质体，过短则菌丝体容易破裂。丝状真菌一般选择年轻的尖端生长点的菌丝；细菌与霉菌一般采用对数生长期，而放线菌以对数期到静止期的转换期为好。[5]（2）稳定剂原生质体由于失去了细胞壁因此对环境十分敏感，渗透压尤为重要。去壁后的原生质体必须保存在高渗的稳定剂中才会保证不被胀裂。稳定剂分为两类：一类是盐溶液，包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2等，浓度为0.3~1.0mol/L；一类是糖溶液，包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖、纤维二糖、鼠李糖等，浓度为0.3~0.6mol/L。易于渗入细胞膜或易被分解的物质不宜作为稳定剂。酵母菌、细菌和放线菌宜用糖溶液，丝状真菌宜用盐溶液。[5]（3）酶解前预处理在使用酶进行酶解细胞壁时，要使酶渗透到细胞壁中。然而微生物的细胞壁具有保护自身的结构，因此在没处理前要进行预处理。对于酵母菌和丝状真菌，可以使用SH-化合物，还原细胞壁中蛋白的二硫键，是肽链间断开连接，没分子容易渗入；对于放线菌，可在培养集中加入甘氨酸，使形成细胞壁时甘氨酸错误替代丙氨酸而干扰细胞壁网状结构的形成；对于细菌，可使用亚抑制量的青霉素，抑制细胞壁黏肽的合成，有利于酶对细胞壁的水解作用。（4）酶系和酶浓度各种微生物的细胞壁组成不同，是用的酶也不同。细菌和放线菌使用溶菌酶来水解细胞壁；真菌使用蜗牛酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶来水解细胞壁。[6-7]随着酶浓度的增加，原生质体的生成率提高。然而酶浓度过低，形成率降低，浓度过高，再生率降低。因此，建议使形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度为最适浓度。[5]（5）酶的作用温度、pH和酶解时间酶的作用温度和pH根据酶和菌种的特性决定。原生质体的形成与酶解时间有关，时间过短，酶解不完全，过长质膜则会收到损伤。因此根据不同菌种的特性来调整。[5]（6）菌体浓度酶解时一般先离心收集菌体，然后加入定量酶液。适当的菌浓可以与酶充分接触反应，提高效果。菌体密度一般以3mL酶液中加入300mg新鲜菌体较合适。[5]（7）酶解方式植被原生质体时应轻轻摇动或敲击管壁让酶与菌体充分混匀，并保持良好的通气条件。[5]2.2原生质体形成率的测定由于原生质体在低渗的蒸馏水中易破裂，因此，可借用这一特性来进行原生质体形成率的测定。用血球计数板分别计算蒸馏水加入前（用A表示）和蒸馏水加入后（用B表示）的完整细胞数，则原生质体形成率可用下式计算：3.原生质体再生原生质体在再生培养基上能重新形成细胞壁，恢复到正常的细胞生活状态。3.1影响原生质体再生的因素（1）菌体的生理状态和细胞结构一般上，年轻的菌体比年老的菌体原生质体易于再生。细胞结构不完整的不具备再生的能力，而具有残留细胞壁的比完全酶解细胞壁的容易再生。（2）稳定剂因为原生质体对渗透压很敏感，因此再生培养基必须是等渗的，其他的与酶解稳定剂相似。[5]（3）培养基组成再生培养基的组成对原生质体的再生影响相当明显。在菌体生长培养基中添加适量的营养因子可有效提高再生率，常用的有酵母膏、蛋白质、氨基酸、水解酪蛋白、琥珀酸钠等。