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天然产物葫芦素ê抑制微丝解聚摘要：虽然小分子的肌动蛋白调制器已广泛应用于作为研究工具，只有一个细胞渗透性的小分子抑制剂的肌动蛋白解聚（jasplakinolide）是市场上买到。我们报告，天然产物葫芦素ê抑制肌动蛋白解聚，表明其作用机制不同于jasplakinolide。使用纯荧光标记的肌动蛋白的检测，葫芦素é具体影响不影响聚合解聚。抑制肌动蛋白解聚亚化学计量浓度的葫芦素E：肌动蛋白。葫芦素?键特异性结合残基Cys257形成共价键的丝状肌动蛋白（ F -肌动蛋白），但不单体肌动蛋白（ G-肌动蛋白）。鬼笔环肽染色的兼容性的基础上，我们将展示，葫芦素é肌动蛋白丝上占据着不同的结合位点。使用后局部光敏荧光损失，我们发现é葫芦素活细胞中抑制肌动蛋白解聚。葫芦素E是一种广泛使用的植物性的天然产品，使其成为一个有用的工具来研究肌动蛋白在细胞和肌动蛋白为基础的过程，如细胞分裂。肌动蛋白是细胞中最重要和最丰富的蛋白质之一。它是细胞骨架的重要组成部分，并参与许多细胞功能，如细胞形态，运动，粘附性，极性和分裂。在细胞中，肌动蛋白以单体形式（ G-肌动蛋白）和丝状形式（ F -肌动蛋白）存在。肌动蛋白的大部分作用是形成长丝和网络，这是通过大量的肌动蛋白修饰蛋白质来严格控制的。这些蛋白质参与肌动蛋白丝的聚合，解聚，和切断蛋白质，像捆绑蛋白质或长丝的交联剂一样参与组织细丝蛋白。尽管有很多关于肌动蛋白的知识，依然也有许多悬而未决的问题，比如它是如何参与它所控制的不同细胞过程的。目标肌动蛋白的小分子在了解肌动蛋白在细胞中的不同角色是非常有效。这些小分子大多源于天然产物，包括抑制肌动蛋白聚合的化合物，如细胞松弛素和拉春库林，以及F-肌动蛋白稳定剂jasplakinolide（图1A）和鬼笔环肽。例如细胞松弛素，有助于我们了解F-肌动蛋白的聚合和调整。事实上，细胞松弛素被用于显示相同的蛋白，肌动蛋白，参与不同的细胞过程，例如细胞迁移，皱裂和分裂和释放，肌动蛋白的聚合是在扇状伪足的的前缘的尖端处发生的。鬼笔环肽，无细胞渗透性，能选择性地结合到F-肌动蛋白，是在固定细胞中肌动蛋白成像的主要工具。我们从锤子形箱果的植株提取物中分离得到了葫芦素F（图1A），在细胞分裂的小分子抑制剂的作用下，葫芦素F能聚合肌动蛋白。许多植物都产生葫芦素，一种三萜类化合物，最初被确定为葫芦科的一种苦味成分。所有的葫芦素都有相同的四环支架，但有不同的取代基（葫芦素A- T），都很容易被糖基化。虽然它们是有毒的，但葫芦素已被用来作为传统药物，例如，西洋苦瓜汁可具有抗炎特性。最近据报道，葫芦素被用作抗肿瘤剂来抑制JAK-STAT途径。这已经有据可查，不同的葫芦素导致肌动蛋白聚合，虽然这种表型的根本原因是一些辩论的主题。在本实验中通过一种新的机制，葫芦素E稳定F-肌动蛋白细丝，并在体外和细胞抑制肌动蛋白解聚。要了解葫芦素肌动蛋白在细胞形态上的显着效果，我们首先评估其对肌动蛋白聚合与解聚的影响。因为市售的葫芦素E被报道与用葫芦素F处理的细胞中观察到的表型类似，所以我们在本研究中使用天然葫芦素E。最常用是用蛋白质或小分子的方法来评估肌动蛋白的聚合状态及其扰动芘肌动蛋白检测。在这个实验中，纯化的肌动蛋白结合到芘的荧光基团，肌动蛋白单体G-肌动蛋白与溶剂分子相互作用而骤冷。当肌动蛋白聚合成F-肌动蛋白，荧光团变得越来越不容易靠近，并开始发出荧光，导致可以检测到的荧光信号的增加。据已报道资料显示，葫芦素é肌动蛋白聚合没有影响，即使在高浓度下也不影响。而细胞松弛素D能减少聚合物的形成，肌动蛋白稳定剂jasplakinolide加速聚合物的形成（补充图S1 ）。要评估葫芦素E对芘-肌动蛋白解聚的影响，我们按照上面叙述的那样预制的F-肌动蛋白，以芘的荧光减少来测量解聚状况。可以通过稀释或加入的单体微丝解聚剂（如维生素D结合蛋白，DNase1，或微丝解聚剂诱导）来诱导解聚反应。维护肌动蛋白单体的微丝解聚剂单体添加浓度为零时可以单独研究解聚反应。与稀释的实验不同的是，微丝解聚剂单体诱导解聚的添加量允许在相同的的荧光范围内对荧光进行连续监测（在同一实验中的聚合和解聚）。因此，我们选择了维生素D结合蛋白的添加量作为我们的主要研究对象，并观察到了与DNase1和latrunculin类似的结果。与以前所报告内容较一致的是，在以稀释为基础的解聚实验中，发现葫芦素E抑制肌动蛋白解聚的模式不同于其他小分子抑制剂（如鬼笔环肽和jasplakinolide）。这两种化合物立即很好的抑制解聚。与此相反，葫芦素E在第一个2分钟内并不影响解聚率，即使小分子与F-肌动蛋白孵育几个小时也不影响（图1B）。这可以解释为什么研究都是使用稀释诱导解聚实验，而我没有提到葫芦素抑制肌动蛋白解聚。随后抑制解聚稳健并持续数小时，这表明葫芦素ēF-肌动蛋