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栽培灵芝生长周期内物质的变化规律及其机制研究 灵芝Ganoderma lucidum(Lesyss ex Fr.) Karst为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌，其作为一种名贵药材在民间及临床具有广泛的应用 现已被《中国药典》2010年版收载。目前，灵芝栽培主要有椴木栽培和熟料袋式栽培。在灵芝的熟料栽培过程中，灵芝在生长发育过程中不断向胞外分泌木质素酶、纤维素酶和蛋白酶降解培养基中 的木质纤维素和蛋白质类物质及其他有机大分子利用其降解产物满足自身生长发育的需要，所以培养基中物质的分解和灵芝物质的合成代谢是一个动态变化的过程，在灵芝菌丝的不同生长时期，不同部位基质中具有不同的理化状态，两者具有密切的关系。但有关灵芝袋式熟料栽培的研究多集中于灵芝的化学成分、药理活性及其生长发育与营养和环境条件的关系而对不同部位基质中物质量和胞外酶活性在生长周期内的变化规律尚未见报道。本研究根据灵芝的生长特点将灵芝的生长期分为 8 个时期，并将基质分为 4 个部位，探讨了不同部位基质中物质量的变化规律，并结合对灵芝胞外酶（木质素酶系、纤维素酶系和酸性蛋白酶）活力在整个发育阶段分泌特点、活性大小和变化规律分析，初步探究了不同部位基质中物质量变化的机制，为提高基质利用率和灵芝产量提供了理论依据，为预测灵芝在自然温度下的栽培特性和栽培产量奠定了基础。 1 材料 1.1 菌种 灵芝 ZL13 由四川省中医药科学院细胞与分子生物学实验室提供，由笔者鉴定。 1.2 材料及试剂 木屑、棉籽壳、玉米芯、麦麸、石灰和石膏购自农资市场，2,2-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）和木聚糖购自 Sigma 公司，其余试剂均为国产分析纯。 2 方法 2.1 培养基的配制 2.1.1 母种培养基配制 土豆 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 自然。 2.1.2 原种培养基配制 玉米粒 99%，石膏 1%，pH 自然，含水量 60%左右。 2.2 栽培培养基配制及栽培方法 木屑 15%， 棉籽壳 60%， 玉米芯 15%， 麦麸 8%，石灰 1%，石膏 1%，pH 5～6，含水量 60%左右。玉米芯加水预湿 24 h，将木屑、麸皮、玉米芯、石灰和石膏混合均匀，掺入预湿的玉米芯中拌匀。选用 23 cm×42 cm×0.03 cm 的聚乙烯袋，每袋装湿料 2 000 g， 121 ℃高压灭菌 2.5 h，冷却至室温后于专用接种室内接种，每袋接入玉米粒原种 10 粒，接种后移入人工气候箱，25 ℃、空气相对湿度 60%、避光培养至菌丝长满袋。出原基阶段将培养条件改为 27 ℃、空气相对湿度 80%、光强 300 lx。出芝阶段培养条件为：27 ℃、空气相对湿度 90%、光强 500 lx。催蕾和出芝均在人工气候箱内进行。 2.3 采样方法及粗酶液制备 把灵芝生长期分为 8 个阶段： 1/4 满袋（时期 1）、2/4 满袋（时期 2）、 3/4 满袋（时期 3）、满袋 （时期 4） 、原基期 （时期 5：灵芝刚长出的白色球状子实体） 、菌蕾期 （时期 6：白色球状开始分化，有突起产生） 、开片期 （时期 7：灵芝为肾形，有淡黄色边缘） 、 子实体成熟期 （时期 8：弹射孢子） 。将培养料均分为 4 部分，分别标记为 I、II、III 和 IV。取不同时期的菌丝与培养料混合物 25 g （3 个重复），贮存于?70 ℃保存备用。准确称取同一待测样品两份，每份 5 g，一份用于制备酶液以测定酶活，一份在 80 ℃恒温干燥箱内烘至恒质量。将称好的样品（5 g）放入 50 mL 三角瓶中，加蒸馏水 25 mL，在 40 ℃恒温水浴锅内浸提 2 h，三层纱布过滤，10 000 r/min 离心 10 min，上清液即为粗酶液。2.4 胞外酶活性测定采用 ABTS 法 测定漆酶活力，漆酶活力单位定义为每分钟催化 1 μmol ABTS 氧化所需要的酶量；纤维素酶和滤纸酶活力测定采用 3, 5-二硝基水杨酸（DNS） 比色法 其酶活力单位定义为每分钟催化生成 1 mg 葡萄糖所需要的酶量；半纤维素酶活性测定参照李江华等的方法 半纤维素酶活性单位定义：每克干培养料 10 min 内催化底物生成 1 mg木糖所需的酶量为 1 个酶活性单位；酸性蛋白酶活性测定参考王福荣的方法，蛋白酶活性单位定义：每克干培养料 1 min 内水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需的酶量为 1 个酶活性单位。 2.5 基质中物质量测定 总糖和还原糖量采用 3, 5-二硝基水杨酸比色法（DNS） 游离氨基酸量测定采用茚三酮显色法 水溶性蛋白量测定采用考马斯亮蓝法 基质中总糖量的变化反映了灵芝在生长发育过程中消耗糖