脾B杂交瘤细胞制备单克隆抗体.docVIP

脾B杂交瘤细胞制备单克隆抗体 实验目的 利用能分泌特异性抗肿瘤免疫球蛋白IgG的脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合制备脾B杂交瘤细胞。 利用脾B杂交瘤细胞制备单克隆抗体。 实验原理 肿瘤细胞与脾脏细胞融合、杂交瘤细胞筛选、体外原代培养技术、细胞的传代培养、细胞的冻存与复苏、细胞计数以及MTT法、单克隆抗体的制备。具体如下： 1、脾B细胞：B淋巴细胞约占脾内淋巴细胞总数的55%，在肿瘤抗原刺激下转化为浆细胞，继而分泌特异性抗肿瘤的免疫球蛋白IgG，且具有抗原提呈能力.研究发现，脾脏切除后，机体免疫球蛋白含量异常且血清IgM水平明显下降，从而影响肿瘤的发生、发展。 2、脾B杂交瘤细胞：已癌化的淋巴细胞(骨髓瘤细胞)具有在体外增殖的能力。用P EG使淋巴B细胞和骨髓瘤细胞融合时， 可得到具有双方性状的杂交瘤细胞， 将其再进行纯株培养后，则可在人工培养基上增殖，由此获得能产生单抗的B细胞杂交瘤细胞。 3、单克隆抗体：单抗具有识别“自己” 和“异己”的能力， 当它发现致病细胞(如病毒和癌细胞)便与之结合。此时，体内的巨噬细胞便蜂拥而上，将其杀死。所以，许多种单抗被作为抗癌剂使用。另外，还可用单抗制作靶向药物(导弹药物)，即在单抗上共价结合毒素或抗癌药物，使其象一枚携带着弹头的火箭射向井摧毁癌细胞。近年来， 又研究把药物包埋于脂质体内， 再与单抗偶联， 注入癌组织中． 它可很快地选择癌细胞融合，这样既能特异地作用于癌细胞， 也可提高药物有效浓度，从而有效地杀伤癌细胞。此外， 单抗还可用作免疫诊断试剂。单抗具有高度的专一性，可用于定量检测体液中的激素，酶和其它蛋白质的变化。其灵敏度和准确度是多壳隆抗血清所不能比拟的。 4、HAT培养基对杂交瘤细胞进行筛选。细胞融合物中包含： 脾-脾融合细胞：不能生长，脾细胞不能体外培养。 骨-骨融合细胞：不能利用次黄嘌呤，但可通过第二途 径利用叶酸还原酶合成嘌呤。氨基蝶呤对叶酸还原酶有抑制作用，因此不能生长。 骨-脾融合细胞：在HAT中能生长，脾细胞可以利用次黄嘌呤，骨细胞提供细胞分裂功能。 5、原代培养：原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。 细胞生长分为：悬浮生长、贴壁生长。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足以下基本要求：一给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、气体条件（二氧化碳、氧气）、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节，严格控制无菌条件。 培养成功的标志：细胞正常分裂。 传代培养：传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。 7、MTT法：又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 8、细胞的冻存与复苏：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，