GB/T 27538-2011动物流感检测　A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法.pdf

ICS 11．220 B 41 a雷 中华人民共和国国家标准 GB／T 27538--20 11 动物流感检测 A型H 1 N 1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 Animal influenza detection--Method of pyrosequencing for HA and NA in influenza virus A(H1 N1) 2011-11-21发布 2012—03—01实施 宰瞀鹳紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19 前言GB／T27538--2011本标准按照GB／T．1—20 9给出的规则起草。由中华人民共和国农业部提出。全国动物防疫标准化技术委员会(sAC／TC81)归口。起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。主要起草人：徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林祥梅、韩雪清、朱来华、张鹤晓、单虎。 1范围 动物流感检测A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 GB／T 27538--20 11 本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型HINl流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸 序列检测方法。 本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB／T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB／T 18088出入境动物检疫采样 GB 19489实验室生物安全通用要求 NY／T 541 动物疫病实验室检验采样方法 SN／T 1193基因检验实验室技术要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATP：三磷酸腺苷(adenosine triphosphate) DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) DEPC：焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) PBS：磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate belaneed solution) Pyrosequencing：焦磷酸测序 RT-PCR：反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction) RNA：核糖核酸(ribonucleie acid) Taq酶：Taq DNA聚合酶 4原理 焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交，与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧 光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APs)、荧光素孵育，逐一加人四种dNTPs(dATP，dTTP，dCTP， dGTP)，如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，释放焦磷酸基团(PPi)；ATP硫酸化酶在 APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化，氧化荧 光素发出与ATP量成正比的可见光信号；光信号由电荷耦合检测器(CCD)收集并由软件转化为峰。 每个光信号的峰高与反应中掺人的核苷酸数目成正比。ATP和未掺人的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸 酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。 】 GB／T27538--20115试剂和材料．1除特别说明外，本标准所用试剂为分析纯或生化试剂，所有试剂均用无RNA酶污染的器具(用DEPC水处理)分装，实验用水符合GB／T6682的规定。焦磷酸测序用引物(对)序列见附录A。3AMV反转录酶。4Taq NA聚合酶。PyrooldSqAReagentsDN 序列分析试剂盒或其他等效试剂。6NTPs。7琼脂糖(电泳纯)。8三氯甲烷9异丙醇1070％乙醇：配制方法见附录B。分子量标准品(100bp～2000)。2裂解液：Trizol或其他等效总RNA提取试剂。S：配制方法见附录B。41 ×PCR缓冲液：建议使用厂家提供，如需配制见附录B。5电泳缓冲液：配制方法见附录B。6溴化乙锭贮存液： 水配制成10mg mL。7 加样缓冲 配制方法见附录B。磁珠悬 。仪器设备 仪。96孔板。真空吸附器。CR仪5冷冻离心机(最大离心力129以上)。6微量移液电泳仪紫外检 仪9LE p dorf管采样 样品制备采样按照 Y／T41和GB80 选取样品 样品处理和其他实验活动符合GB9 9的有关规定。2 品处理．1鼻腔拭子样品在混 器上充分混合后， 高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，3离心5r in，取上清液 GB／T 27538--20” 转入无菌的1．5 mL Eppendorf管中，编号备用。 7．2．2肌肉或组织脏器 取待检样品2．0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL PBS混匀，4℃， 3 00