GB/T 27538-2011动物流感检测 A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法.pdf

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  •   |  2012-03-01 实施

GB/T 27538-2011动物流感检测 A型H1N1流感病毒中HA、NA的焦磷酸测序检测方法.pdf

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GBT27538-2011动物流感检测A型H1N1流感病毒中HANA的焦磷酸测序检测方法

ICS 11.220 B 41 a雷 中华人民共和国国家标准 GB/T 27538--20 11 动物流感检测 A型H 1 N 1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 Animal influenza detection--Method of pyrosequencing for HA and NA in influenza virus A(H1 N1) 2011-11-21发布 2012—03—01实施 宰瞀鹳紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会“19 前言GB/T27538--2011本标准按照GB/T.1—20 9给出的规则起草。由中华人民共和国农业部提出。全国动物防疫标准化技术委员会(sAC/TC81)归口。起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。主要起草人:徐彪、梁成珠、凌宗帅、张太翔、岳志芹、高宏伟、孙涛、方绍庆、林祥梅、韩雪清、朱来华、张鹤晓、单虎。 1范围 动物流感检测A型H1N1流感病毒中 HA、NA的焦磷酸测序检测方法 GB/T 27538--20 11 本标准规定了焦磷酸测序技术用于A型HINl流感病毒及其墨西哥变异株中的HA和NA核酸 序列检测方法。 本标准适用于A型H1N1流感病毒通用及A型H1N1流感病毒墨西哥变异株的核酸检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088出入境动物检疫采样 GB 19489实验室生物安全通用要求 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 SN/T 1193基因检验实验室技术要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ATP:三磷酸腺苷(adenosine triphosphate) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) PBS:磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate belaneed solution) Pyrosequencing:焦磷酸测序 RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction) RNA:核糖核酸(ribonucleie acid) Taq酶:Taq DNA聚合酶 4原理 焦磷酸测序是通过测序引物和PCR扩增单链DNA模板杂交,与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧 光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶和底物(APs)、荧光素孵育,逐一加人四种dNTPs(dATP,dTTP,dCTP, dGTP),如与模板配对,此dNTP与引物的末端形成共价键,释放焦磷酸基团(PPi);ATP硫酸化酶在 APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化,氧化荧 光素发出与ATP量成正比的可见光信号;光信号由电荷耦合检测器(CCD)收集并由软件转化为峰。 每个光信号的峰高与反应中掺人的核苷酸数目成正比。ATP和未掺人的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸 酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系。 】 GB/T27538--20115试剂和材料.1除特别说明外,本标准所用试剂为分析纯或生化试剂,所有试剂均用无RNA酶污染的器具(用DEPC水处理)分装,实验用水符合GB/T6682的规定。焦磷酸测序用引物(对)序列见附录A。3AMV反转录酶。4Taq NA聚合酶。PyrooldSqAReagentsDN 序列分析试剂盒或其他等效试剂。6NTPs。7琼脂糖(电泳纯)。8三氯甲烷9异丙醇1070%乙醇:配制方法见附录B。分子量标准品(100bp~2000)。2裂解液:Trizol或其他等效总RNA提取试剂。S:配制方法见附录B。41 ×PCR缓冲液:建议使用厂家提供,如需配制见附录B。5电泳缓冲液:配制方法见附录B。6溴化乙锭贮存液: 水配制成10mg mL。7 加样缓冲 配制方法见附录B。磁珠悬 。仪器设备 仪。96孔板。真空吸附器。CR仪5冷冻离心机(最大离心力129以上)。6微量移液电泳仪紫外检 仪9LE p dorf管采样 样品制备采样按照 Y/T41和GB80 选取样品 样品处理和其他实验活动符合GB9 9的有关规定。2 品处理.1鼻腔拭子样品在混 器上充分混合后, 高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出,3离心5r in,取上清液 GB/T 27538--20” 转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中,编号备用。 7.2.2肌肉或组织脏器 取待检样品2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10 mL PBS混匀,4℃, 3 00

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