GB/T 27644-2011禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法.pdf

Ics 11．220 B 41 a宦 中华人民共和国国家标准 GB／T 27644--20 1 1 禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法 Protocol of real—time PCR for detecting Gallid Hepers Virus 2 201 1-12-30发布 2012-04-01实施 宰瞀鳃鬻瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促19 刚禹GB／T27644--201本标准按照GB／Tll--2009的规则起草。由中华人民共和国农业部提出。全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC81)归口。起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、扬州大学、河南农业大学。主要起草人：詹爱军、刘文博、王新卫、卢体康、花群义、陈书琨、秦智锋、陈兵、高小博。 标准分享网 免费下载 1范围禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法本标准规定了禽疱疹病毒2型荧光PCR检测的操作方法。适用于 的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件GB／T7644—2011下列文件对 本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语缩略语适用于本文件。ct值：每个反应管内 信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA：deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸。d TP xy- nucleosidetr phosphate三磷酸脱氧核糖核苷。含有dCTP、dGTP、dATP、TTP四种脱氧核糖核苷。ED A； th leneiarnin e raac tiid乙二胺四乙酸。HV：GallmHepersVirus禽 疹病毒2型(马立克氏病病毒血清1型)。M ：Marek’Sseas 马立克氏病。P S ph sph tb lane dso ut n磷 盐缓冲生理盐水。CR olymerasehr ac 聚合酶链式反R l—timeR al—timp ym 时荧光聚合酶链反应。Taq酶 T muqu t cusym s 耐热DNA聚合酶。4试剂．1试剂级别：除另有规定，本 试验用水应符合GB／T规定的二级水，所 化学试剂均为分析纯。禽疱疹病 2型荧光PCR检测试剂盒，一20℃保存，组成及使用注意事项参见附录A。3引物和探针序列(产物长度142p)上游 ：5’CCACCACCT CCA TGTAC’ GAC AGG GAG GTAAAccM n探针：5’ c c GcTc G A c GAcAc ATG，其5 端和3’端分别标记F M和BHQ(或T mra或E lipse)4％肝素钠，配制方法见B．1，4℃保存。5三氯甲烷，常温保存 标准分享网 免费下载 GB／T27644—20114．6异丙醇，使用前预冷至--20℃。7无水乙醇。875％乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20℃。90 01mol／LP S，pH7．2，配制方法见B． 。5器材和设备菌注射器，1L，51025 0。 一次性无菌塑料袋。31 5无DNA酶和RNA酶的Eppendorf管。4 mL无DNA酶和RNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板。荧光PCR检测仪。高速台式冷冻离心机，可控温至4℃、离心速度可达12009以上。振荡器。8研钵。9普通冰箱和超低温冰箱：规格2℃～8℃ --20℃，一80℃。微量移液器，0此～2p lL～10止 10v 0儿 202 此 1 0止～10 并配备与移液 匹配的无DNA酶和RNA酶的吸头。6样品的采集和处理样品的 集．1全血用预先加入 ％肝素钠的无菌注射器直接吸取全血至无菌Eppendorf管中，盖上管盖并编号。2羽毛 组织脏器取待检羽毛OA根部挤出少量羽髓)、肝脏 肾脏和脾脏样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号 送实验室贮运样品采集后 放人密闭 塑料袋内(一个采样点的样品，放一个塑料袋) 于保温箱中加冰、密封，送实验室。3 处理3 离心30in 取棕黄色层转人无菌的1．5Eppendor{管中，加入50洗涤，15弃上清 编号备用。或样品 ．0g加入 mLH7． 的 ．01mol／L于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，分装编号备用 标准分享网 免费下载 GB／T27644—20116． 样本存放制备的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置一70℃以下，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)，淋巴细胞样品在2℃～8℃条件下保存。7核酸提取及荧光PCR检测1注意事项实验室注意事项见附录C。2核酸提取．1 n个灭菌的1．5mLEppendorf管(n为被检样品之和)，编号。2每 加入250pDNA提取液(参见附录A)，然后分别加入被检样本各250，