生物化学3动物细胞工程制药详解.ppt

6、流化床和固定床反应器 3.7 动物细胞产品制造实例 一、类淋巴细胞干扰素(Na-IFN-α ，interferon IFN) 由Namalva细胞（淋巴瘤患者中分离获得）生产 搅拌罐生物反应器悬浮培养（8000L） 80% IFN-α(多种亚型) ＋20% IFN-β 细胞逐级扩大 培养（8000L） 10%小牛血清RPMI1640 1×106 /ml 丁酸钠或IFN启动 仙台病毒诱生 单抗或多抗亲和层析 TCA沉淀 超滤浓缩 收获离心 Na-IFN-α 48h 18h Sephadex G75 二、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA） 人t-PA基因位于第8号染色体p12~q11.2区 14个外显子和13个内含子 全长36,594bp t-PA为单链 527aa MW 67,000~72,000 等电点7.8~8.6, pH 5.8~8.0稳定 17对二硫键 三个糖基化位点 275Arg- 276Ile 能被纤溶酶、组织激肽释放酶作用裂解成双链。 作用机理： 游离t-PA对纤溶酶原亲和力很低，不产生激活作用。 t-PA对血栓中纤维蛋白有很强亲和力，与纤维蛋白结合后的t-PA能够激活纤溶酶原，形成纤溶酶，纤溶酶在血栓部位水解纤维蛋白，使血栓溶解。 少量进入血液的纤溶酶能可被α2-抗纤溶酶作用失活。 纤维蛋白 t-PA t-PA 纤溶酶原 纤溶酶 纤溶酶 α2－抗纤溶酶 t-PA 的生产： 采用CHO工程细胞株生产 微载体 搅拌式灌流培养 、流化床灌流培养 Verax 2000(24L)流化床反应器 灌流 330L/d，20g/d, 27d t-PA 的纯化： 螯合锌琼脂糖层析 ConA琼脂糖层析 凝胶过滤 Streamline SP 阳离子扩张床 赖氨酸-Sepharose 4B 赖氨酸可与t-PA 的Kringle结构区（K2）结合 t-PA 用量 一般100mg（15mg/2min + 50mg/30min + 35mg/60min ） 90min内再通率 75% 颅内出血率 0.6% t-PA 的改造： 体内半衰期很短(3.5+1.5min) Reteplase（r-PA） Tenecteplase（TNK-t-PA）(17 +7min) TNK-t-PA采用CHO工程细胞表达，生产工艺与t-PA基本相同，用药量由100mg下降至40mg。 Asn103 (Thr) Gln117 (Asn) Ala296 -Ala -Ala -Ala (Lys-His-Arg-Asp) PAI-1 纤溶酶原激活剂抑制物 3.8 动物细胞制药的前景与展望 一、改进表达载体 提高表达水平和产量 1、采用更强的启动子和增强子 2、利用扩增系统或寻找高表达位点 提高基因拷贝数： 与筛选标记基因共扩增 二氢叶酸还原酶dhfr基因，防止氨甲蝶呤MTX毒害 自我复制型载体，以附加体形式存在 pCEP4(1～90) pABWN (50~100) 整合到染色体“热点”: 筛选基因和报告基因两侧加入人工重组酶位点 目的基因替换 二、采用和改造更好的宿主细胞 不局限于CHO 细胞融合 基因工程改造宿主细胞(增加或减少某种酶或蛋白)： 降低对营养物质的要求 将胰岛素样因子和铁传递蛋白转入CHO细胞，能够直接在无血清培养基中培养。 减少某些代谢产物的产生 谷氨酸转移酶 杂交瘤细胞KB-26.5 无谷氨酸培养基生长，氨检测不出 控制工程细胞的过度增殖 诱导表达一些抑制细胞生长的蛋白。 三、改进培养工艺 提高表达量，降成本 四、抑制细胞调亡 防止营养和氧的缺乏 用化学添加剂阻断细胞调亡 抗调亡基因改造工程细胞 五、糖基化工程 O-糖链对蛋白质特性影响不大，N-糖链对产品可