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Integrated continuous winemaking process involving sequential alcoholic and malolactic fermentations with immobilized cells 影响因子：2013:2.524 被引频次：2 常若毅 1504007 在集成连续葡萄酒生产过程中用固定化细胞进行顺序的酒精和苹果酸乳酸发酵 目录 一、摘要 二、前言 三、材料和方法 四、结果及讨论 五、结论 一、摘要 一个完整的酿酒过程-----包括酒精和苹果酸乳酸发酵的连续操作。对于连续酒精发酵、酵母被固定在葡萄茎或葡萄皮，而细菌细胞进行连续的苹果酸-乳酸发酵的葡萄皮只被固定在葡萄皮上。所生产的葡萄酒进行化学分析，通过高效液相色谱法分析乙醇，甘油，糖和有机酸等，并通过气相色谱法分析挥发性和微挥发性化合物。 二、前言 在葡萄酒生产中最重要的两个过程是酒精发酵（AF）和苹果酸乳酸发酵（MLF），分别由酵母细胞（酿酒酵母）和细菌（酒类酒球菌）进行发酵。 在传统的酿酒发酵过程是在不连续模式进行，即在分批操作下进行的。然而，连续的过程是众所周知的，要优于分批操作。连续的过程操作简单，能量的要求低，并降低了运行成本。 连续酒精发酵和苹果酸乳酸发酵，使用的微生物细胞经常被固定在天然有机和无机材料。然而，传统的连续过程，在维持在生物反应器中的高细胞浓度有局限性。为了克服这一困难，固定化的酵母或细菌细胞系统提供高的细胞密度与高流速。 本研究的主要目的是集成酒精发酵（AF）和苹果酸-乳酸发酵（MLF）在一个连续的连续酿酒过程。为了实现这一整体目标，分别实施AF和MLF是不同的填充床反应器进行固定化酿酒酵母和酒类酒球菌的操作。 Fig. 1. Schematic representation of the integrated process of continuous winemaking. 三、材料和方法 1.菌剂的制备 2.固定化细胞的支持物 3.发酵实验的培养基成分 4.反应器的准备 5.发酵实验 6.自由细胞和固定化细胞的测定 7.发酵参数 8.理化分析 9.HPLC分析 10.GC分析 11.统计分析 1.菌剂的制备 （1）商业酿酒酵母用于酒精发酵AF （2）商业酒类酒球菌用于苹果酸乳酸发酵MLF 500mL三角烧瓶中培养（200mLYPD培养基） 离心(7000rpm,20mim) 蒸馏水清洗 菌剂悬浮液 500mL三角烧瓶中培养（200mLMRS培养基） 离心(7000rpm,100mim) 蒸馏水清洗 菌剂悬浮液 2.固定化细胞的支持物 葡萄皮和葡萄茎（白葡萄品种），分别被用来作为细胞固定化的支持材料。这些支持物是由当地的酿酒公司提供，用蒸馏水洗涤并60℃干燥直至恒重。然后，在使用前121℃下灭菌20min。 3.发酵实验的培养基成分 用于酒精发酵的复合培养基: 葡萄糖（120克/ L），酵母膏（4克/升），（NH4）2SO4（1 g/L）、磷酸二氢钾（1 g/L） 和硫酸镁（5 g/L）。 用于苹果酸-乳酸发酵培养基： 葡萄糖（15克/ L），酵母提取物（4克/升），肉提取液（8 g/L），细菌蛋白胨（10 g/L）、硫酸镁（0.2 g/L），硫酸锰（0.05 g/L）、醋酸钠（5克/升），吐温80（1 g/L），二磷酸氢（2克/ L），二氢铵柠檬酸（2克/ L）和苹果酸（4克/升）。 4.反应器的准备 连续酒精和乳酸发酵试验在不同的填充床反应器（内径7.2厘米），总体积约1750毫升。采样端口，分别在20厘米和37厘米的高度，相应的到工作体积（空床的体积），814毫升和1506毫升。两个反应器都采用向上流动模式。 使用前，至少在发酵4 d之前用次氯酸钠对反应器进行消毒溶液（1.5%活性氯）。然后，在装支持物前反应器用5体积的灭菌水清洗。在每个反应器底部，有1厘米高度的玻璃珠（6毫米直径）。 5.发酵实验 首先，对于细胞的固定化，反应器在分批处理模式下进行操作。然后，在分批处理后48小时后，反应器被切换到一个连续模式，并在不同的稀释率进行（图2）。所有操作稳定后，葡萄汁取代复杂的培养基进行酒精发酵和苹果酸-乳酸发酵。连续AF和MLF最初是分开进行的。经过优化的工艺条件下，两个反应器联系在一起。（集成式） 6.游离细胞和固定化细胞的测定 （1）固定化细胞用牛鲍式计数板进行测定。 （2）死/活细胞通过剧烈搅拌0.5克的支持物30克/ L溶液氯化钠30分钟分开。然后，游离的细胞用亚甲基蓝染色，用牛鲍式计数板进行测定