生物信息学在高通量测序数据中的应用讲述.ppt

高通量测序技术Life/APG’s Ion torrent PGM 454发明者的新作品 测序反应在微阵列芯片上的微反应池中进行。 每个dNTP结合到延伸链上，会释放出一个H+，pH值变化会导致电位变化。 检测每次dNTP流过的电位差变化，就能知道该dNTP是否连接上去。 高通量测序技术Life/APG’s Ion torrent PGM 优点：速度快( 2 hours)，准确度较高（只需要1次聚合反应，电位变化与碱基数量线性关系较好），成本低，芯片可升级 缺点：读长较短(max 200 bp)，通量较低(max ~1G) 已有升级版Ion Proton，号称比Ion torrent强100倍。 Ion torrent 318 chip Ion Proton 高通量测序技术Pacific Bioscience’s single molecule sequencing 每个纳米孔底部固定一个已经结合了引物和模板的DNA聚合酶分子。 每次测序反应加入一种荧光标记的dNTP核苷酸，聚合酶在检测空间内将其捕获后产生光曝。 通过连续实时检测每个孔内的荧光信号，就快速测定了每个孔内的模板序列 高通量测序技术Pacific Science’s single molecule sequencing 优点：读长长 (max 15 kb) 缺点：错误率高 (单次反应错误率~15%。经改进后使用多次循环重复，错误率降低到1%)，通量低（与读长有关） SMAT Cells Comparison of 5 NGS techniques 454 Solexa SOLiD Ion torrent Pacific 文库制备 乳滴PCR 桥式PCR 乳滴PCR 乳滴PCR 单分子 测序反应 聚合反应 聚合反应 连接反应 聚合反应 聚合反应 原理 焦磷酸 反向终止合成 可剪切探针连接 pH电位差 单分子实时荧光 光学检测 是 是 是 否 是 最大读长 ~1 kb 250 bp 75 bp 200 bp ~ 15 kb 最大数据产出* 700 Mb 600 Gb 300 Gb ~1.2 Gb ~80 Mb 运行时间 较短 长 最长 短 短 主要错误 Indel 替换 替换 Indel CG删除 准确率 低 高 最高 较高 低 平均数据成本 高 低 低 较低 高 数据分析难度 较低 高 最高 高 最低 *最大数据产出量往往不是最大读长的文库 HiSeq 2500和Ion Proton均号称1天测1个30x的人类基因组，成本$1000 高通量测序技术 的主要应用 DNA测序 基因组deno测序 基因组重测序 宏基因组(Metagenome)测序 外显子组测序 RNA测序 转录组测序 表达谱测序 小RNA测序 降解组测序 表观基因组测序 Chip-seq Clip-seq 生物信息学在高通量测序数据中的主要应用 常用生物信息学分析平台与资源 常用编程分析平台：Perl / BioPerlPython / BioPythonR / BioconductorJAVA / BioJava 常用网上资源：NCBI SRA – Sequence Read ArchiveUCSC Genome BrowserSEQanswers – WiKi Forum for NGS 常用基因组拼接软件 Velvet Ray ABySS SOAPdenovo SSAKE SHARCGS MIRA Edena 基因组比对软件 BLAST BLAT MAQ SOAP Bowtie BWA SSAHA ELAND SNP 分析软件 SAMTools SOAPsnp NGS-Backbone MAQ SeqMan NGen CLCBio Genomics 生物信息学在基因组分析方面的应用基因组de novo测序 对未知基因组序列的物种 取样： 动物：血液、肌肉 植物：叶片（黄化叶，组培植株） 估算基因组复杂度（大小、重复序列比例、杂合度） 测序技术： Illunima paired-end为主 Sanger、454、SOLiD为辅， PacBio目前也开始用于基因组测序补洞 文库构建 尽量随机打断 WGS (whole genome shortgun) Coverage depth（覆盖深度or测序深度）： 每个碱基被测序的平均次数，是用来衡量测序数据量的首要参数。 测序总数据量/基因组大小 Coverage ratio（覆盖率）： 被测序到的碱基占全基因组大小的比率。覆盖比率随覆盖深度升高而提高，亦受测序bias的影响，如illumina测序会受到GC bias的影响，而导致测序不均匀。 理论上（完全随机打断）