生物化学检验常用技术讲述.pptx

第三章 生物化学检验常用技术 光谱分析技 电化学分析技术 干化学分析技术 电泳分析技术 基因扩增技术 第一节 光谱分析技术 吸收光谱分析技术 发射光谱分析技术 散射光谱分析技术 一、吸收光谱分析法 4 光源 单色器 吸收池 检测器 显示器 钨灯、卤钨灯 350～1000 氢灯、氘灯 180～360 滤光片 棱镜 光栅 玻璃比色皿 石英比色皿 5 (一)、分光光度技术的基本原理 1、吸光度与透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即： T = I/I0 T×100%为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即： 6 2、Lambert-Beer定律 Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。 A = KLC A 为吸光度； K 为比例常数，称为吸光系数； L 为溶液层厚度，称为光径； C 为溶液浓度 Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体 当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶液浓度成正比。 L Lambert-Beer定律适用于: 可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体以及分散均匀的固态或气态样品. 单色光 均匀介质 吸收物质无相互作用 3、Lambert-Beer定律的应用条件 4、Lambert-Beer定律的偏离现象 溶液：稀溶液、化学变化 光学; 非单色光、散射和折射 仪器; 光源、实验条件 在分光光度法中，为消除显色剂及样品中各种共存有色物质产生的干扰、抵消比色皿和试剂对入射光的影响而用来调节仪器百分透光率为100%的溶液。 5、空白溶液的选择 蒸馏水 试剂 样品 不含待测元素 不显色 1、溶剂空白：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）作参比溶液。 选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色离子时，选用溶剂参比。 2、试剂空白：用不加样品，而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液。 选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其他有色离子时，选用试剂参比。 3、样品空白：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。 选择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。 4、平行操作空白：按样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品进行平行操作， 以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。 选择原则：当操作过程中由于试剂、器皿、水和气等因素引入了一定量的被测试样组分的干扰离子 5、不显色空白：可将一份试样加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂 和其它试剂均按照操作手续加入，以此作为参比溶液，这样可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。 选择原则：当显色剂和被测试样均有颜色时，可选用此法。 (二)、分光光度法在生化检验中的应用 灵敏度高、操作简便、应用广泛 1、对未知化合物进行定性分析 2、对待测物质进行定量测定 定性依据： 最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε 标准曲线法和比较法 11 (1).标准曲线法 根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。 方法： 13 2．比较法 CR=(AR ×Cs)/As 己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓度，计算公式为： 二、发射光谱分析法 处于激发态的待测元素，原子回到基态时以辐射的形式释放出能量，由此而产生的光谱称为发射光谱，对元素进行定性与定量分析的方法。 发射光谱是指样品本身产生的光谱被检测器接收；吸收光谱是光源发射的光谱被样品吸收了一部分，剩下的那部分光谱被检测器接收。 火焰光度法 荧光光度法 火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。 它是一种简化的发射光谱分析法 （一）、火焰光度法 FP640