生物药物与检测高效液相色谱法讲述.ppt

溶剂吸滤头的清洗 1.取下吸滤头放在(1:4,V/V)的硝酸溶液烧杯中超声清洗15分钟; 2.取出后用蒸馏水超声清洗10分钟; 3.用吸球吹出吸滤头中的液体; 4.再用蒸馏水超声清洗10分钟; 5.用吸球吹净吸滤头中的水份; 6.将吸滤头重新插入管路并放入溶剂瓶中(正相系统注意将吸滤头烘干) 流程 5重新连接色谱柱，设定适当流速，当流动相流出约30倍于色谱柱体积，并且检测器基线平衡后，流动相更换完毕 流动相的更换——更换互溶流动相 1将新流动相置于储液瓶中(已过滤和超声处理的) 2打开排空阀，启动泵,使新的流动相从排空阀出口流出20ml左右 3关闭排空阀，然后将进样阀与色谱柱相连接端卸开，用小容器放置于进样阀的出口处 4启动恒流泵，让流动相从进样阀出口流出10ml左右 泵的使用与维护注意事项 防止任何固体微粒进入泵体（用0.22um或0.45um的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、密封圈，最终产生漏液 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性和分析结果。 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动 色谱柱的保养 8 9 4 5 6 1 2 3 7 0 xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx 000 0 000 0 LC-10AD ::::::: 输液时不要打开排液阀 瞬间压力剧烈变化 当柱子和色谱仪联接时，阀件或管路一定要清洗干净 要注意流动相的脱气 避免使用高粘度的溶剂作为流动相 进样样品要提纯 控制进样量 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般为甲醇） 常见问题 分析原因 解决办法 峰形展宽 “鬼峰” 脱尾峰 双重峰或 分叉峰 流动相就比如人体的血液，其质量直接影响到整个系统的正常运行与否。 ?应该使用HPLC级的溶剂，不能互相混溶的溶剂不可以直接切换！一般在水相和与其不混溶的溶剂切换时，使用异丙醇作为过渡溶剂。 ?注意溶剂的截止波长。截止波长是指该溶剂可以在紫外检测器中使用的 最低波长,低于该波长后,溶剂会有很强的紫外吸收，从而影响极限的稳定性、干扰对所分析物质的检测。 四、HPLC常见故障与维护 1、HPLC对流动相的一般要求 第*页/共49页 ? HPLC所使用的水必须是新鲜的和经过0.45μm滤膜过滤过的。建议每天更换新鲜的水。长期不用时，必须把使用水的管路用有机溶剂置换，防止长霉。 ?仪器使用完后要采用适当的溶剂冲洗等方法维护色谱柱和系统。如果使用了缓冲盐一定先将盐要冲洗干净。 ?仪器长期不用时，不建议使用纯乙腈封存。因为乙腈有生成聚合物的趋 势。建议使用甲醇、甲醇/水或乙腈/水封存。 ?当有流路堵塞时，可以尝试将之反接后冲洗。污染的溶剂或溶剂瓶里的藻类生长将会缩短溶剂过滤器的使用寿命，并且影响泵和系统的的性能。这在水溶剂或磷酸盐缓冲液(pH 4 至7) 中尤其如此。 第*页/共49页 3 传质阻抗 由三个系数组成： C＝ Cs ＋ Cm＋Csm Cs——固定相传质阻抗 Cm——流动相传质阻抗 Csm——静态流动相传质阻抗 GC中，固定液的传质阻抗起决定作用， C＝Cs。而HPLC中， “固定液”是键合在载体表面固定液官能团的单分子层，厚度df可以忽略。因此，Cs可以忽略。 （1）固定相传质阻抗 （2）流动相传质阻抗Cm 由于在流路中心的流动相中的组分分子还来不及扩散进入流动相和固定相界面，就被流动相带走，因此总是比靠近填料颗粒与固定相达到分配平衡得分子移动得快些，从而使色谱峰变宽。 Cm与固定相颗粒粒度dp得平方成正比，与组分分子在流动相中得扩散系数成反比。 ωm是由柱和填充的性质决定的因子 （3）静态流动相传质阻抗Csm 由于固定相的多孔性，使部分流动相滞留在固定相微孔内。流动相要与固定相进行质量交换，必须先扩散到微孔内。如果固定相的微孔多，且又深又小，传质阻抗就大，使峰展宽就严重。 Csm固定相颗粒粒度dp得平方成正比，与组分分子在流动相中得扩散系数成反比。 ωsm与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关。 H=A+Cmu+Csmu 原因：化学键合相，液体流动相, 结果：HPLC的实验条件应该是：①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动相，流速不宜过快；③柱温适当。 HPLC中的速率理论 1