第十六章DA的复制与修复--王镜岩《生物化学》第三版笔记(完美打印版).doc

第十六章DNA的复制与修复 第一节 DNA的复制 一、半保留复制 （semi-conservation replication） （一）证据： 1.用氮15标记大肠杆菌DNA，然后在氮-14中培养，新形成的DNA是杂合双链，即双链中一条是重链（约重1％），一条是轻链。第二代则有一半全是轻链，一半是杂合双链。 2.大肠杆菌DNA在用氚标记的胸苷复制近两代，放射自显影，未复制部分银密度低，由一条放射链和一条非放射链组成；已复制部分有一条双链是放射的，一条双链有一半是放射的。这证明大肠杆菌DNA是环状分子，以半保留方式复制。 （二）特点：子代保留一条亲代链，而不是将它分解。这说明DNA是相对稳定的。双螺旋DNA（或RNA）是所有已知基因的复制形式。 二、复制的起点和单位 （一）基因组能独立进行复制的单位称为复制子。原核生物是单复制子，真核生物是多复制子。每个复制子有起点。通过测定基因出现的频率可以确定起点位置，距离起点越近的基因出现的频率越高。起点有发动复制的序列，也有决定拷贝数的序列。起点的结构是很保守的。 （二）复制终止点：已发现Ecoli的与复制终止有关位点，其中含有23bp的保守序列，由tus蛋白与此位点结合参与复制的终止。真核生物中似乎没有复制终止点。 （三）复制多数是双向、对称的，但也有例外。通过放射自显影可以判断复制是双向还是单向：先在低放射性培养基中起始复制，再转移到高放射性培养基中，如是双向复制，其放射自显影图是中间银密度低；单向复制则为一端低。 （四）单向复制有一些特殊方式： 1.滚动环：噬菌体φX174DNA是环状单链分子，复制时先形成双链，再将正链切开，将5’连接在细胞膜上，从3’延长，滚动合成出新的正链。 2.取代环：线粒体DNA复制时是高度不对称的，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，呈D环形状。这是因为两条链的复制起点不同，另一条链的起点露出才能复制。 三、有关的酶 （一）反应特点： 1.以四种dNTP为底物 2.需要模板指导 3.需要有引物3’-羟基存在 4.DNA链的生长方向是5’-3’ 5.产物DNA的性质与模板相同 （二）大肠杆菌DNA聚合酶 1.DNA聚合酶I：单链球状蛋白，含锌。有聚合酶活性和外切酶活性，其中3’-5’外切酶活性起校正作用，5＇-3＇活性起修复和切除引物作用。DNA聚合酶I主要起损伤修复作用。每秒可聚合10个碱基。切除氨基端5＇-3＇外切酶活性后称为Klenow fragment，用于引物标记等。 2.DNA聚合酶II：单链，以切口双链DNA为模板，作用不清楚。 3.DNA聚合酶III：起DNA复制作用，功能与聚合酶I相似。全酶共10种亚基，含锌。每秒可聚合1000个碱基。 （三）真核生物DNA聚合酶：有a、b、g、δ、ε五种，性质与大肠杆菌的酶相似，多无外切酶活性。a相当于聚合酶III，用于引发、滞后链合成；b主要起修复作用，γ位于线粒体，δ合成前导链，但前50个碱基由a合成。 （四）DNA连接酶：使双链DNA切口处的5’-磷酸和3’-羟基生成磷酸二酯键。需供能，细菌用NAD，动物和噬菌体用ATP，形成焦磷酸键的活化形式，再由3’羟基发动亲核攻击，形成磷酸二酯键。大肠杆菌的连接酶作用于粘末端，T4的还可作用于平末端。 四、半不连续复制 （semi-discontinuocos replication） （一）复制叉由5’向3’方向连续复制，称为前导链；另一条链复制叉由3’向5’移动，而DNA复制方向不变，形成许多不连续片段，称为冈崎片段，最后连接成完整的DNA，称为滞后链。 （二）首先由引物合成酶由5’向3’方向合成10个核苷酸以内的RNA引物，然后聚合酶III在引物3’-羟基上合成DNA，再由聚合酶I切除引物，填补空白，最后DNA连接酶将冈崎片段连接起来，形成完整DNA。 （三）复制具有高度忠实性，其错配几率约为10-10，从热力学上考虑，碱基发生错配的几率约为10-2，酶对底物的选择作用和校正作用各使错配几率下降10-2，所以体外合成DNA的错配几率为10-6。体内复制叉的复杂结构提高了复制的准确性，修复系统对错配加以纠正，进一步提高了复制的忠实性。 五、解链 复制时必需解链，如靠旋转，则大肠杆菌DNA要达到每分钟6000转。其实复制时是用拓扑异构酶和解螺旋酶来解链的。拓扑异构酶I可切断一条链，牵引另一条链通过切口，再连接起来。每次可消除一个负超螺旋，不需要ATP。同转录有关。拓扑异构酶II每次引入2个负超螺旋，需要ATP。引入负超螺旋可消除复制叉前进带来的张力，促进解链。解螺旋酶通过水解ATP来解开双链，每对碱基需2个ATP。单链结合蛋白(SSB)可与解开的单链结合，防止复性和水解。 六、DNA复制体的结构 七、与DNA复制有关的酶和蛋白质因子由30多种，他