蛋白质和茚三铜.docVIP

三,蛋白质的转化含蛋白质较多的豆类种子萌发时,蛋白质在蛋白酶的作用下水解产生氨基酸.氨基酸与水合茚三酮共热时,能产生紫色化合物.因此可根据紫色的深浅来确定蛋白质转化成氨基酸的量.本实验所需要的材料和用具包括:发芽和未发芽的大豆种子,台天平,研钵,试管,试管架,滤纸,滴管,80%酒精,1%水合茚三酮.脯氨酸含量测定测定方法采用茚三酮染色法［?470），而亚氨基酸，则生成黄色化合物（?440）。在一定的反应条件下，产生的颜色的强度（溶液中的光吸收）与氨基酸浓度成比例，根据溶液的吸光度，可以算出相应的氨基酸和蛋白质的浓度。 茚三酮反应（ninhydrin reaction）：　　 在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应。 有关电泳基本知识： 8分钟 （一）电泳：带电颗粒在电场的作用下向着其电性相反的电极移动，称为电泳。（ electrophoresis） （二）电泳迁移率：同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。 蛋白质的等电点 (pI) ： 　　　在一定的介质中，某一蛋白质解离成阴、阳离子的趋势相等，成为两性离子 (净电荷为零),此时介质的pH称为蛋白质的等电点。 　　　　　不同的蛋白质因所含酸性或碱性氨基酸的比例不同，等电点亦不相同。根据蛋白质等电点的不同可通过电泳进行分离蛋白质。 免疫电泳可测蛋白质浓度蛋白质的鉴定。免疫电泳技术是将琼脂电泳与免疫扩散相结合的 - 种常用的免疫学实验方法，此项技术有抗原抗体反应的高度特异性，电泳分离技术的快速，灵敏和高分辨力，以及实验设备和操作简便等优点，是免疫学的一种基本技术，目前，该技术衍生出了对流免疫电泳、火箭电泳、交叉免疫电泳及免疫固定电极等许多新技术和新方法，用于科学研究和临床实验诊断根据电泳的分离特点及工作方式，电泳可分为三大类： （l）自由界面电泳：在二根U形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，它们逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面。 （2）区带电泳：在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。根据所用的支持物不同可分为：纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和十二烷基硫酸纳（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 （3）高效毛细管电泳：是在一根内径约50μm的毛细管中，在高压电场下进行样品分离分析的一种新型电泳技术。 （二）常用电泳法的类型及其应用 1．纸电泳法纸电泳法是用滤纸作为支持介质的一种电泳法，其操作要点如下： （1）缓冲液的选择：应根据供试品的理化特性，需要的电泳速度和分辨力，选择适宜的缓冲液、pH值和离子强度。 （2）滤纸的裁剪：滤纸可按需要裁成与电泳槽相当的长方形或长条形，样点的间距为2～3cm，滤纸长度视电源输出最高电压及所需的电场强度而定，电压恒定时，所需场强越大，滤纸裁得越短。 （3）点样方法：分干点法与湿点法。干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次直至点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿。干点法能浓缩供试品，适用于稀的供试品溶液。湿点法是将滤纸全部浸入缓冲液中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，滤纸点样部分需用架子架起，点的次数不宜过多，稀的供试品溶液应预先浓缩。湿点法优点是可保持供试品的天然状态，点样后立即接通电源以免扩散。 （4）电泳及区带显示：将点好的滤纸放电泳槽上。控制电压、电流和电泳时间。电泳后，滤纸从槽中取出，晾干或烘干。不同的供试品采用不同的显色方法，如核苷酸类药物可直接在紫外光灯下观察定位，而有些物质必须用显色剂显色。 （5）定量测定：纸电泳的定量方法与纸色谱的定量方法一样，可以用洗脱法或光密度计扫描法进行。但目前光密度计扫描法已被醋酸纤维素薄膜电泳法取代。这是因为在纸电泳法中，支持物滤纸对蛋白质样品的吸附力较大，且滤纸本身为极性物，透明化步骤较烦，不利于光密度计扫描法定量测定。 纸电泳法可用于蛋白质、核苷酸等生化药物的测定。如核苷酸，具有共轭双键的嘌呤或嘧啶碱基，在一定的pH条件下，具强紫外吸收，电泳后滤纸在紫外光灯下显示紫色，用铅笔定位，剪下相应的部位，进行洗脱，在特定波长下测定供试品的吸收度，按其吸收系数可计算出某一核苷酸的含量。三磷酸腺苷二钠（ATP）的含量测定即属于此类。 ATP在生产中易带入ADP等杂质，储存中也易分解成ADP，因而采用纸电泳分离ATP后的分光光度法进行测定。测定方法如下： 取本品，精密称定，加水制成每1ml中约含10mg的溶液，照中国药典附录纸电泳法测定。电泳毕，取出吹干，置紫外光灯（254nm）下检视，用铅笔划出跑在滤纸最前面的紫色斑点，剪下供试品斑点和与斑点面积相近的空白滤纸并