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革兰染色法(Gram stain) (一)原理：几种学说 1、等电点学说：G+菌的等电点比G-菌的等电点低，在同一pH条件下，阳性菌比阴性菌所带电荷要多，与带正电荷的碱性染料结合力强，不易脱色。 2、化学学说：G+菌含有大量核糖核酸镁盐，与进入细胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95％乙醇脱色，而G-菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。 3、细胞壁结构学说：G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚且具有三维空间结构，脂类含量低，乙醇不易透入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘的复合物渗出，而G-菌的细胞壁较疏松，肽聚糖层薄且无三维空间结构，含脂质量高， 易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫和碘的复合物被溶出而脱色。目前认为细胞壁与化学组成上的差异是染色反应不同的主要原因。 (二)试剂：  l、结晶紫溶液 2、革兰碘液 3、95％乙醇 4、稀释石炭酸复红 (三)操作步骤： 细菌标本涂片固定后，先用结晶紫(或龙胆紫)初染lmin；小水流冲洗后加碘液媒染1 min；小水流冲洗后用95％乙醇脱色1 min；小水流冲洗后稀释复红复染30sec，小水流冲洗后使涂片自然干燥，镜检。 (四)结果判定： 1、革兰阳性细菌：不被乙醇脱色仍保留紫色为革兰阳性菌(G+菌)，如葡萄球菌、链球菌等。 2、革兰阴性细菌：若被乙醇脱色后再被复染成红色者，为革兰阴性菌(G-菌)，如大肠埃希菌、伤寒沙门菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等。 (五)革兰染色的重要实际意义： 1、鉴别细菌：可将所有细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类，有助于进一步鉴别。2、选择药物的参考，临床上可根据病原菌的革兰染色性，考虑选择有效的药物进行治疗。 3、与致病性有关：许多革兰阳性菌能产生外毒素，而革兰阴性菌则大多能产生内毒素，两者致病作用不同。 细菌的接种方法( 一 )器材： l、接种针和接种环:它们由镍铬合金或白金丝制成。接种环的直径约2 --4mm，一个合格的接种环是正圆形，连接端没有空隙；接种针长50—80mm。两者上端连接有一绝缘柄的金属棒，全长为145mm。 2、固体培养基 3、酒精灯 (二)接种方法： 主要应用平板划线法。另外还有琼脂斜面接种法、穿刺接种法、液体培养基接种法、倾注平板接种法和涂布接种法。平板划线法分为分区划线法和连续划线法。 (三)平板划线法操作步骤： 1、接种环在火焰上灭菌。 2、用灭菌后的接种环取标本。 3、在固体培养基上划线接种。  (四)判断接种效果：要求接种后平板上划线轨迹连续、平滑，平行的划线之间不可重合，平板经孵育培养后，应沿划线出现单个菌落。 室内质控操作步骤(一)前期准备工作 室内质控分为最佳条件下的变异(OCV)和常规条件下的变异(RCV)两种情况，前者反映实验室最佳状况下的质控情况，而后者反映实验室日常情况下的质控情况。 l、最佳条件下的变异(OCV)OCV表示本室在当前条件下该项目检测所能达到的最好精密度水平，是本室工作水平的一个基础指标。 OCV测定采用与常规工作相同的检测方法、试剂和仪器，但应保证测定是在本室所能达到的最理想、最稳定的情况下进行。 比如所用仪器等应新近经过校准，试剂新鲜配制，由操作熟练、富有经验的人员进行。在测定全过程中应尽量控制温度、光照、反应时间等一切可能影响测定结果的因素。 选择瓶间差小、稳定性良好的质控品，每天做4、5批测定，每批一瓶质控品，在4、5天内即可得到至少20份数据，分别计算其、S、CV值，此CV值即为OCV。所测得的OCV综合表达了批间和日间精密度。 2、常规条件下的变异(RCV) RCV表示本室在当前条件下常规工作中该项目检测的精密度水平。RCV的测定方法与对应的OCV测定方法相似。不同点仅在于测定RCV时应使用与常规工作完全相同的条件，而不要有任何特殊对待。 即应当把质控品完全当成病人标本，每天由该项目常规检测的操作者将它随病人标本同批检测，以便真实反映常规检测的精密度。在常规室内质量控制工作中，每更换一次质控品的批号， 均应对新批号的质控品进行RCV测定。RCV是常规条件下的变异，是日间精密度的表达指标。因此，测定时质控品必须保证使用和标本相同的处理条件，而且每天要重新启用一瓶，并只测一次。 20个数据要来自20天测定。一天内测多个数据，甚至一批内测多个数据，或每天将一瓶质控品分成若干份，测定后求均值作为当天的数据等做法均是错误的。这样得出的RCV往往比真实情况要小一些。RCV的计