八非线性色谱原理及其在蛋白质分离与纯化中的应用.PPTVIP

第八章 非线性色谱原理及其在蛋白分离与纯化中的应用 第一节 概述 色谱法起源于20世纪初，1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为Хроматография，这个单词最终被英语等拼音语言接受，成为色谱法的名称。汉语中的色谱也是对这个单词的意译。 一、色谱法的基本特点 1、分离效率高 2、应用范围广 3、操作参数多 4、高灵敏度在线检测 5、快速分离 6、连续自动化操作 1、分离效率高 每米可达十几万个理论塔板，几个厘米的色谱柱就可以分离多组分的蛋白质混合物。 2、应用范围广 从极性到非极性，离子型到非离子型，小分子到大分子，无机到有机及生活物资，以及其它热稳定或热不稳定的化合物，可以说无所不包。尤其是对生物样品的分离分析，是其他方法无法代替的。 3、操作参数多 流动相可以是气体、液体或超临界流体。各种流体中又有不同的物质可选用。 固定相可用液、固两大类，每类中又有许多种可供选择。 二、线性色谱与非线性色谱 线性和非线性是数学函数的概念，表示自变量与应变量之间的关系。在色谱学中，如果流动相中样品浓度Cm与固定相中样品的浓度Cs之间呈线性关系，那么在这种情况下的色谱分配过程就是线性色谱，即： Cs=KCm K为分配系数。Cm流动相中样品的浓度。Cs固定相中样品的浓度 非线性和线性色谱行为的根本不同表现在以下几个方面 1、样品的保留值可变。 2、峰形不对称。 3、色谱峰的峰高与浓度不是线性关系 第二节 非线性色谱理论基础 非线性色谱理论是研究样品在固定相与流动相中的浓度处于非线性关系的状态下，各种实验参数对色谱分离过程的影响，建立起柱参数、溶质性质及操作条件之间的定量关系式。由于此时Cs与Cm不呈线性关系，所以必须首先了解他们之间的函数关系，也既要研究吸附等温线及相应的吸附模型。 一、吸附过程及吸附等温线 吸附指一种通常发生在两相界面上的现象：处于界面上的分子或原子与其内部的分子或原子具有不同的能量与性质，产生了一种不平衡的倾向，造成界面的分子或原子数与内部不同，这种差异就形成了吸附现象。 吸附过程主要分为两大类：化学吸附和物理吸附 化学吸附热大，吸附过程往往是不可逆的，而物理吸附热小，吸附往往是可逆的。 吸附等温线信息 1、可以预测代表了该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状。 2、为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件。 3、反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型与吸附状态。 4、建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。 吸附等温线的测定 吸附等温线的测定可以分为静态法与动态法两大类。 1、静态法：较简单，是一种经典的方法，是将被测物质溶解在溶剂中配成一定浓度的溶液，再放入一定量的固相吸附剂，等体系达到平衡后，根据溶液浓度的减少（△C）、溶液体积（V）和吸附剂量（G），就可以计算溶质在吸附剂上的浓度（q） q= △C×V/G 配制一系列溶液浓度，可以得到一系列q值，将q与其相平衡的C做图，即可得到该溶质在液固系统中的吸附等温线。 2、动态法 动态法最早是用气相色谱原理来测定气固或气液两相中的吸附等温线的，常用的有4种方式： ①前沿分析（FA）； ②特征点前沿分析（FACP）； ③特征点洗脱（ECP）； ④平台洗脱（EP）。 1、吸附平衡热力学 当被分离的物质在色谱系统中达到热力学平衡时，它在液相与固相中的浓度关系可用吸附平衡方程式表示。 2、吸附平衡动力学 色谱分离过程实际上是一个由不平衡到平衡、周而复始的连续过程。平衡的速率由下式可以表达为： 第三节 非线性色谱的实验方法 由于非线性色谱涉及的样品浓度大大高于线性（分析型）色谱的，因此通常的分析型色谱仪及其流程就不完全符合非线性色谱的要求，某些部件必须加以改造才能满足要求，以便于在优化条件下使用，而且在实验方法上也需加以适当的改变。 一、非线性色谱中的固定相及色谱柱 1、固定相 在生物大分子分析型高效液相色谱中的固定相目前几乎都是用细颗粒大孔径的填料，但是在非线性色谱中，粗和细的可以两者都在使用。原则上讲细颗粒填料的柱效要高，但价格也贵。粗颗粒填料虽柱效低，但价格便宜，而且柱压降低适合于大型制备柱。 分离生物大分子的主要填料 1、反向填料：烷基链长是很重要的因素。反向填料上键合的烷基链长似乎与蛋白质的分子量也有反相的关系