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实验四 植物DNA的大量提取与Southern杂交 第一天 一、植物DNA的大量提取 CTAB法：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注:CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性。NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中。β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染，同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 材料：转基因植株 步骤： 取20 mL CTAB提起液于50 mL离心管中，65℃预热。 取5克新鲜幼嫩叶片，加液氮磨成粉末，转入盛有预热提起液的离心管内，迅速搅拌均匀。 于65℃水浴提取1 h。冷却至室温。 加等体积氯仿-异戊醇（24∶1），充分混合均匀。 离心（4000r/min，15分钟）。 上清液用等体积氯仿-异戊醇抽提1次（4000 rpm，15 min）。 上清液中加入2/3体积的异丙醇，摇匀。此时应有絮状DNA出现。 挑出DNA， 置于10 mL离心管中。加76％乙醇浸泡1 h 离心（3000 g，4℃）15 min 沉淀DNA用76%乙醇洗2次，自然晾干 沉淀加入5 mL 1 mol/L pH8.0 TE buffer，5 μL RNase A（1.0 mg/）6℃温浴至全部溶解 加入预冷的等体积的氯仿-异戊醇(24：1)，摇匀，4°C静置10 min，离心(3000 g, 20 min) 上清液加入1/10体积5 mol/L NaAc，2倍体积乙醇，-20oC放置1 h或过夜。 离心(12000 g, 20 min)，沉淀用75%洗2次 转移至95％的乙醇中，浸泡5 min 将DNA自然晾干，溶于1 mol/L pH8.0的TE溶液中，贮于4℃待用。 第二天 二、DNA浓度的测定及调整 待DNA完全溶解后，用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量。取2 μL DNA 溶液加98 μL H2O，混合。取5μL 进行琼脂糖凝胶电泳，以λ/Hind III为标准，凝胶扫描后估算DNA含量。通过稀释将DNA浓度调至250－300 ng/μL左右。 三、 DNA的酶切、电泳、Southern转移 1. 浓度调至250－300 ng/μL的DNA用常见的限制性内切酶（EcoRI）进行酶切，取总DNA 2.5-3 μg，8U 的限制性内切酶，特异的酶切缓冲液1.7 μL，用ddH2O使总体积为17 μL，37℃酶切过夜。PstⅠ/EcoRⅠ/BamHⅠ 样品编号 内切酶 Buffer类型 17 μL反应体系中各成分用量（μL） DNA Buffer enzyme RNase H2O Total 1 EcoR I 3 1.7 0.5 17 第三天 2. 取2 μL 酶切反应混合液进行电泳检测， 3. 当酶切完全后进行酶切片段的电泳分离。电泳时琼脂糖浓度为0.8％，电压40V，待溴酚蓝指示带到达前缘后停止电泳。 4. 转膜 用0.2 mol/L HCl变性8分钟， 用0.4 mol/L NaOH 作转移液将凝胶中的酶切片段通过虹吸作用转移至Hybond N＋尼龙膜上（约需24 h）。 第四天 将膜用2×SSC洗2次，每次5 min，置于干净滤纸上晾干，晾干的膜于已预热至85℃左右的干燥箱中烘干（约3 h），或紫外照射3 min。保存于4℃备用。 四、Southern杂交 原理 North2South?生物素标记和化学发光检测Kit采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dTP掺入到合成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性DNA探针。杂交洗膜后，DNA上的生物素与链亲和素标记的HRP结合，最后与Pierce 的化学发光底物发光检测，灵敏度可以与32P相媲美。 步骤： 1）在65℃水浴中预热将准备好的膜置于杂交盒中，加入预热的 10 mL（将膜完全淹没，每平方厘米膜至少0.1ml杂交液。除了RNA:RNA杂交用65℃外，其他的都用55℃），盖