常用分子微生物技术的原理及其应用.doc

基因敲除技术及其应用 科学界预言，21世纪是一个基因工程世纪。1866年，奥地利遗传学家孟德尔神父发现生物的遗传基因规律1953年，美国生化学家华森和英国物理学家克里克宣布他们发现了DNA的双螺旋结果，奠下了基因工程的基础翻开了生命科学的新篇章随后，遗传的分子机理DNA复制、遗传密码、遗传信息传递的中心法则、作为遗传的基本单位和细胞工程蓝图的基因以及基因表达的调控相继被认识。从而DNA重组技术与转基因生物技术发展到了人工设计与合成全基因、基因调控网络，乃至基因组的一个新的历史时期 重组DNA技术最初是用来将DNA片段克隆到微生物宿主中，以过表达特定的基因产物用于进一步研究。重组DNA分子也已经用于获得遗传修饰生物体，如转基因和“基因敲除”动物以及转基因植物。已经对生物学和医学产生巨大影响，并且由于整个人类基因组的核酸序列已经被了解，极可能会产生更大的影响。成千上万种未知功能的基因将采用重组DNA技术来进行研究。基因治疗可能成为某些疾病的常规疗法，采用遗传工程技术将可以设计出许多新的基因转移载体。同样地，采用重组DNA技术获得的转基因植物将可能在现代农业中扮演日益重要的角色。涉及到构建或使用GMOs的实验应首先进行生物安全评估与该生物体有关的病原特性和所有潜在危害可能都是新型的，没有确定的。供体生物的特性、将要转移的DNA序列的性质、受体生物的特性以及环境特性等都需要进行评估。这些因素将有助于决定安全操作目标遗传修饰生物体所要求的生物安全水平，并确定应使用的生物学和物理防护系统。 这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命技术是20世纪80年代发展起来的，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。所谓胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后，将它重新植回胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时，结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换的可能，这种重组称为同源重组。通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。 RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的[1]。 1．利用同源重组进行基因敲除 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)技术的基础上逐步完善发展起来，主要是利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导人靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合人内源基因组内，使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。该技术已从最初简单的完全敲除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定时间基因敲除的可调控敲除方向发展。完全基因敲除是通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除；而条件基因敲除则是将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段，即通过位点特异的重组系统实现特定基因敲除，现阶段以噬菌体的Cre／Loxp系统和酿酒质粒的FLP／FRT系统应用得最为广泛[1]。 2.利用随机插入突变进行基因敲除 利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T—DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除[2]。以农杆菌介导的T—DNA插入突变适用于多种植物，可以直接在植物基因组DNA中产生稳定的插入突变，而且插入位点的随机性较强，但是它只适用于那些容易被T—DNA转化的植物，且常常会引起的染色体重排现象，使突变体表型与T—DNA插入无关而难以进行遗传学分析。尽管如此，近年来将T—DNA插入突变应用于拟南芥还是获得了广泛的成功[1]。转座子插入突变是利用了转座子在染色体上可移动的特点，当它跳跃插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。