微生物量碳的测定方法.doc

氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳 一、采样与样品预处理 土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。 土壤田间持水量采用改进的Shaw（1958）方法测定。在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗用玻璃纤维堵塞。取50.00 g土壤于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50 ml水，保持30 min，再打开夹子使多余的水流入量筒，30 min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量，用烘干土壤质量表示。——林启美老师文件内容 二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE） 1、方法原理 土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。 浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。 2、仪器及设备 培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。 3、试剂 无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[((H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。（试剂浓硫酸 ((H2SO4)=95~98% ，稀释19倍） 硫酸钾溶液[c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1]: 称取硫酸钾（K2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于去离子水中，稀释至1L。(需加热溶解) 重铬酸钾[c(1/6K2Cr2O7)=0.2000 mol·L-1]: 称取经130 oC烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）9.8110g，溶于1000mL的去离子水中。 重铬酸钾标准溶液：[c(1/6K2Cr2O7)=0.1000 mol·L-1]: 称取经130 oC烘干2～3h的重铬酸钾（K2Cr2O7，分析纯）4.9055g，溶于1000mL的去离子水中。 邻啡罗啉指示剂：称取邻啡罗啉指示剂[C12H8N2·H2O，分析纯]1.49g，溶于含有0.70g FeSO4·7H2O的100mL去离子水中，密闭保存于棕色瓶中。 硫酸亚铁溶液[c(FeSO4)=0.05 mol·L-1]：称取硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)约13.9005g，溶解于600～800mL去离子水中，加浓硫酸（化学纯）20mL，搅拌均匀，定容至1000mL，于棕色瓶中保存。此溶液不稳定，需在用时每天标定其浓度。 硫酸亚铁溶液浓度的标定： 吸取重铬酸钾标准溶液5.00mL，放入100mL三角瓶中，加水约20mL,加浓硫酸5mL和邻啡罗啉指示剂2滴，用FeSO4溶液滴定，根据FeSO4溶液的消耗量即可计算FeSO4溶液的准确浓度。 硫酸亚铁溶液标定方法：吸取0.1000 mol L-1（1/6 K2Cr2O7）(试剂4)5.0ml，放入150ml三角瓶中，加浓硫酸5ml和邻啡罗啉指示剂2滴，用硫酸亚铁溶液滴定，滴至溶液由蓝绿色变为棕红色即为终点。根据滴到终点消耗的硫酸亚铁溶液量计算其准确浓度，即C2 =（C1 ( V1）/ V2。 式中： C1—重铬酸钾标准溶液浓度（0.1000mol L-1）； C2—硫酸亚铁标准溶液浓度（mol L-1）； V1—吸取的重铬酸钾标准溶液体积（5ml）； V2—滴到终点时消耗硫酸亚铁溶液体积（ml）。 4、操作步骤 4.1薰蒸 称取相当于20.0g烘干土重的湿润土壤3份，分别放在约100 mL的烧杯中，一起放入同一干燥器中，干燥器底部放置小烧杯盛装少量的水以保持湿度，同时放入一个装有50mL NaOH溶液和一个装有约50mL的无乙醇氯仿的小烧杯(根据干燥器的大小可以增加氯仿的用量，同时加入少量的直径约为0.5mm的碎瓷片)，用少量凡士林密封干燥器，用真空泵抽气至氯仿沸腾并保持至少2 min。关闭干燥器的阀门，在25oC的黑暗条件下放置24h。 打开阀门，如果没有空气流动的声音，表示干燥器漏气，应重新称样进行薰蒸处理。当干燥器不漏气时，取出装有水、碱液和氯仿的烧杯，氯仿倒