抗体工程重点总结.doc

简答题 简述鼠源性单抗的改造原则及常见类型 改造原则：降低其免疫原性、尽量保持其亲合力 常见类型：人鼠嵌合抗体、CDR移植抗体、小分子抗体 噬菌体抗体库技术的主要流程及优点 噬菌体抗体库技术：借助噬菌体展示技术，将抗体V基因与噬菌体外壳蛋白基因融合表达于噬菌体表面，从而构建噬菌体抗体库，然后通过筛选获得特异性抗体的V区基因。 主要流程： 扩增全套抗体基因 构建合适的重组噬菌体表达载体 转化大肠杆菌并保存 优点： 省时省力 筛选容量大 直接得到抗体基因 可制备人源抗体和其它难于制备的抗体 可原核表达 缺点： 库容受转化效率限制：一般不超过1010 一些抗体分子会抑制宿主菌生长 具极高亲和力的抗体与抗原结合后，难以洗脱，造成丢失 简述基因工程抗体的各表达系统的优缺点 哺乳动物细胞表达系统： 优点： 具有完整的转录、翻译后加工及分泌机制，抗体能被准确子合成、加工和分泌 具有完全糖基化功能和完善的重折叠机制，可表达形成良好活性的抗体分子 可实现抗体的分泌表达 既可表达完整的抗体分子，也适合表达其它形式的小分子基因工程抗体 缺点： 构建周期长，操作繁琐 表达量相对低，成本较高 大规模生产受限 具潜在致癌性和病毒核酸的污染可能 常用的宿主细胞 淋巴细胞：主要是小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO 非淋巴细胞：常有的细胞有CHO、COS 大肠杆菌表达系统： 优点： 遗传背景清楚 产量高：130—150mg／L 生长速度快 操作简单 成本低 可大规模生产 不足 不具有糖基化功能，不适合表达完整抗体分子 抗体产物多为无活性的包涵体形式 存在的致热原污染可能 酵母表达系统： 优点 遗传背景清楚，易操作，生产成本低，产量高1.2g/L 具备较好的加工修饰功能，可得到较高活性的抗体分子 消除了大肠杆菌中的致热原和哺乳动物细胞中潜在致癌性和病毒核酸的污染 缺点： 存在过度糖基化（50/20）影响抗体活性 具备较好的加工修饰功能，可得到较高活性的抗体分子 消除了大肠杆菌中的致热原和哺乳动物细胞中潜在致癌性和病毒核酸的污染 昆虫表达系统：常用的体系有两种：一种是以重组杆状病毒为载体；另一种是稳定转化昆虫表达体系。 特点：具有必要的翻译后修饰、加工及分泌能力可表达各种形式基因工程抗体表达量高 转基因动物表达系统： 特点 可产生完全人源抗体 表达抗体具高亲和性 抗体具多样性 可通过杂交瘤等制备功能性抗体 植物表达系统： 优势 生产成本低 可大规模种植已 种子形式保存种系 受人类病原体污染的危险性最小 人一鼠嵌合抗体的制备 改造依据 抗体的免疫原性主要C区 主要流程 免疫动物 制备杂交瘤 克隆鼠源单抗的可变区基因 克隆人抗体恒定区基因 构建包含鼠V区和人C区的重组表达载体 哺乳动物细胞表达(如骨髓瘤细胞、CHO细胞) 特点 可减少90%以上免疫原性 具有完备的免疫功能 不易被清除 不足 仍有一定免疫原性 CDR移植抗体的制备 改造依据 CDR直接形成抗原表位结合结构 改造分类 移植抗体 表面残基人源化—镶面抗体 移植抗体 改造原则 选择FR，最大可能维持抗体的天然构象 将FR中可能影响抗原结合部的AA替换为亲本AA 合适保留CDR两侧骨架序列 可将抗体N末端数个AA（L）一起移植 须在降低免疫原性和保持亲和力权衡 改造方法： 置换法：以人Ig为骨架，以鼠抗体CDR置换人抗体的CDR 定点突变法：用定点突变的方法将人V区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列 制备过程： 制备杂交瘤 克隆V区基因 设计移植抗体V区基因序列（mCDR+hFR） 构建V区基因 与人C区基因相连 构建H和L链表达载体 哺乳动物细胞表达 常用的几种抗体表达系统的优缺点 淋巴细胞表达系统：主要是小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、NSO 特点 本身不产生和分泌任何Ig 具备抗体表达的原生条件和环境 可产生完全活性的抗体分子 适合表达各种重组抗体 产量偏低：5μg/ml 稳定性不高 非淋巴细胞表达系统：常有的细胞有CHO、COS CHO：目前最主要的基因工程抗体生产细胞，常用的属CHO工程株 特点： 遗传背景清楚 转染效率高 适用于多种载体 可表达各种类型的抗体 可长期稳定表达有功能活性抗体 可无血清培养和高密度发酵 产量可达200μg/ml COS：由SV40病毒的大T抗原转染猴肾细胞获得，可长期传代 特点： 转染的抗体DNA以游离形式存在并复制 外源基因表达迅速，瞬时表达仅需3-6d 适用于研究抗体基因的表达效果以及快速制备少量抗体检测其活性及特征 重组杆状病毒为载体的表达系统：常用载体为多核多角体病毒MNPV。 特点： 具完整的感染性 可容纳100Kb外源片段 不依赖辅助病毒既可包装 可分泌表达完整抗体分子 重组病毒生存短暂，可保证生物安全 不感染脊椎动物