Biorad微滴式数字PCR(DDPCR)技术.docVIP

Bio-rad微滴式数字PCR（DDPCR）技术 革命性的微滴式数字PCR技术,使实体瘤肿瘤负荷的血清学定量分析成为可能??Revolutionary?Droplet?Digital?PCR,Enable?Absolute?Quantification?of?Serum?Tumor?Burden??技术原理??微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，对每个微滴的荧光信号进行逐一分析，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。??技术优势??通过把样本稀释成许多部分，然后在一个反应发生的时候对其进行计数。其灵敏度高达0.001%，显著高于扩增阻滞突变系统（0.1%）和Sanger法测序（10%）。同时能克服核酸降解的不利影响，非常适合一些稀有样本中核酸的精确检测。??高灵敏度、高特异性检测复杂背景下的靶标序列??灵敏度可达0.001%，样本珍贵或者样本核酸存在降解时的最佳选择。在穿刺样本、胸腹水、外周血中即可完成靶标序列的检测。??所需样本量少??200ul血浆或1ml全血/??2-3片白片/??纳克级活检组织。??实验数据分析便捷??每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读，数据分析自动化。??可统计突变率??真正意义上的绝对定量，通过统计分析可得出靶点的突变率。??临床应用??肿瘤早期筛查??微滴式数字PCR技术作为迄今为止最灵敏的检测肿瘤细胞突变DNA的手段，可有效应用于肿瘤的早期筛查。微滴式数字PCR技术可以通过检测患者外周血样对进入外周血循环的肿瘤组织核酸进行分析，相对于传统的PCR检测方法，有更高的灵敏度，可以更好的胜任稀有变异检测的工作，实验数据证实微滴式数字PCR可以实现0.001%的突变频率筛查。??肿瘤病理学辅助诊断??微滴式数字PCR的一个主要优势是所需样本量很低，这对于临床来说特别有意义，尤其是当病理样本太少时，DDPCR可以帮助检测突变，来辅助诊断对药物的敏感性。另外在肿瘤均质细胞内检测单一突变相对简单，但是如果在异质细胞内，在仅存有少量携带突变肿瘤细胞的情况下，突变的特定等位基因是否可以被准确检测到，直接影响到靶向治疗是否有效。微滴式数字PCR?在进行突变/稀有变异检测中发挥着重要的作用，是临床肿瘤样本靶向药物分子检测的不二之选。??图1.在外周血中检测肺癌患者不同浓度样本的EGFR第21号外显子的突变率??肿瘤负荷的实时监控??微滴式数字PCR技术由于可以检测外周血循环细胞中微量肿瘤细胞突变DNA，成为进行肿瘤负荷实时监控的有效手段，判断患者体内肿瘤细胞负荷更加科学、可靠、及时。???图2.通过在外周血中检测肺癌患者KRAS基因某一位点的突变率，来实时监测患者体内肿瘤细胞负荷??药物耐药突变外周血监控??目前，许多肿瘤常规化疗效果差，预后不良是困扰临床的重要难题，而肿瘤多药耐药性则是肿瘤化疗失败的关键因素。经治疗后，残存的肿瘤干细胞耐药性形成，常导致对某些药物治疗敏感性降低，并引起肿瘤复发甚至转移，因此，对药物耐药突变的筛选和监控成为当今医学界研究的热点。??