PCR条带弥散原因.docVIP

PCR体系中存在污染2、电泳槽中电泳缓冲液不净3、电压不稳定4、如果PCR的模板是经过酒精提取的质粒等相关DNA，则酒精没有除净5、退火时间过长或过短，延伸时间过短等 配1000ml的DEPC处理水，加1mlDEPC。 磁力搅拌器搅拌 过夜 。第二天 高压蒸汽灭菌 121摄氏度，25min DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。 最好分装小瓶来用，尽量避免污染。 你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。也就是：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度不合适（有些帖子一味的说Mg2+离子浓度过高会引起非特异性扩增，这是问题的一个方面，Mg2+离子浓度过低也同样会引起非特异性扩增）、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关（过多循环一般是超过25次循环）。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：首先可以提高镁离子的浓度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。提高镁离子的浓度无效的话，调整引物浓度（你的PCR结果电泳拖尾，可能是非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次 数。减低酶量或调换另一来源的酶。适当提高退火温度。以上都不行则要重新设计引物。每种调整均可以分梯度进行 PCR优化问题汇总 PCR在产物序列中引入了错误？参考见解：1 聚合酶忠实性低：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。2 循环数太多：降低循环数。3 四种dNTP的浓度不同：制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。PCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象？参考见解：1模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。模板的质量是最重要的。2抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。3提高退火温度，减少非特异性扩增。4减少循环次数，减少非特异性扩增。5电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变。6电泳时电压不能太高，8V/cm。7一般来讲，基于promega和TaKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。8 加样量过大。过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。9制胶过程中胶孔没制好。10 EB没有冲洗干净。11模板混有基因组DNA，或模板中混有蛋白。12非特异反映。引物设计的不好，非特异，这种情况容易出现非特异扩增造成有非特异性扩增带或拖尾现象。13电泳液用久了不换，电泳胶脏了 。14扩增的条件不合适，一般退火温度低时容易使引物在非特异位置结合引发扩增反应造成拖尾。针对以上情况，可以先提高退火温度试试，如果实在不行，再看看引物是不是合适。。　　如果内参可以扩出来，只能说明程序可能是适合的，但不能完全说明体系合适。体系内的各组分，如模板、dNTP、Mg离子、引物等都可能造成拖尾。先得考虑换了那种成分后出现了拖尾，逐项试验。引物当然是最重要的因素，但绝非造成拖尾的唯一原因。而且，一般而言，拖尾不会是引物的问题，尤其是已经被用过证明能扩出特异片段的 引物，更不可能是它的问题了。先不要加Taq酶，等到其他东西都加完了以后，放到PCR仪上去，到那时再加，马上开启PCR程序试试。检查一下你的dNTP的量够不够。适当减少2～3个循环试试，可能会有效果。PCR结果总是不满意，请问要注意些什么？参考见解：1将PCR反应的试管与反应板紧贴。2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。3不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。4对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。5没有扩增产物： 在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。6泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。7检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。8检查模板和引物的用量。9增加循环次数和/或模板DNA的用量。10泳道中出现模糊条带：