第九章免疫标记技术讲述.ppt

第九章 免疫标记技术 抗原抗体在低含量时形成复合物是不可见的。有些物质即使在超微量时亦可通过特殊的方法将其检测出来，如果将这些物质标记在抗原抗体分子上，可通过检测标记分子来显示抗原抗体的存在。 高敏感性的标记分子主要有荧光素、酶、放射性同位素，由此建立了免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫分析等技术。 特点：敏感性高、特异性强 应用：微生物鉴定、传染病诊断、生物活性物质的测定、基因表达产物的检测。 作为标记荧光素需满足的条件： （1）有与蛋白分子形成稳定共价键的化学基团，且不形成有害产物。 （2）荧光效率高，与蛋白结合的需要量小。 （3）标记后不影响抗体的活性 （4）性质稳定，易保存 （5）激发的荧光与背景颜色有良好的反差。 （6）标记简单，能形成商品 3 荧光抗体染色方法 （1）标本制备 涂片或亚印片：细菌培养物、感染动物的组织、血液、脓汁 切片：感染组织 盖玻片：上面培养单层细胞 标本要求很薄，并要保持抗原的完整性 （2）固定 常用丙酮和95%乙醇，室温固定15~30min，后用PBS反复冲洗，干后即可染色。 固定目的：防止被检材料从玻片上脱落；消除标本内抑制抗原抗体反应的因素；检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定，有利于荧光抗体渗入。 （3）染色方法 有直接法和间接法两种 直接法： A 在标本上滴加2~4个单位的标记抗体，置湿盒中，37℃作用30min B 在大量PBS中漂洗15min， A 在标本上滴加抗SFV血清，置湿盒中，37℃ 作用30 min B PBS漂洗5 min C 加FITC标记的抗抗体，置湿盒中，37℃作用 30 min D PBS漂洗 E 干燥、封载 4 荧光显微镜观察 第二节 免疫酶标记技术 是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立的免疫检测技术。 1966年，Nakane报道用酶代替荧光素标记抗体，建立酶标记抗体技术，用于组织中抗原的定位。 一、原理 酶是有机催化剂，微量的酶可催化大量的化学反应，如果产物为有色可见物，则极为敏感。 E+S (ES) E+P 如果产物没有颜色，则可通过供氢体显色，来显示反应的发生。 E+S (ES)， (ES)+D1 E+P+D2 D1为供氢体，无色，底物水解时，D1由还原型变为氧化型D2，呈现颜色反应。 基本程序 1 酶分子与抗原或抗体分子共价结合 2 酶标抗体或抗抗体与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异结合，并洗下未结合的物质。 3 滴加底物溶液，底物在酶作用下显色；或底物不显色，但在底物水解过程中，由另外的供氢 二、用于标记的酶 标记酶应具有的特征： 1 高度的特异活性和敏感性； 2 在室温下稳定； 3 易于获得并能商品化生产； 4 与底物反应的产物易于显现 （一）辣根过氧化物酶 广泛分布于植物中，辣根中含量最高，称（horseradish peroxidase,HRP)。。 其作用底物为过氧化氢，催化时需要供氢体。 供氢体主要有：邻苯二胺（OPD）、联苯二胺（DAB）、四甲基联苯胺（TMB） OPD的氧化产物可溶解于水，呈橙色，最大吸收波长为490nm TMB 产物溶于水，呈兰色，加氢氟酸终止反应，在650nm测定；用硫酸终止，呈黄色，450nm下测定 DAB的氧化产物不溶于水，呈黄褐色 （二）碱性磷酸酶（AKP） 从牛小肠黏膜和大肠杆菌中提取 底物常用对硝基苯磷酸盐，酶解产物呈黄色，可溶解，最大吸收波长400nm。 三、常用的免疫酶标记技术 （一）免疫组织化学染色 1 标本制备 与免疫荧光相同 2 标本处理 用1%~3%的H2O2甲醇处理标本，低温条件下，作用10~15分钟，可同时起到固定和消除内源酶的作用。 3 封闭 10%卵白蛋白（OVA）或0.05%Tween-80和含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS对标本处理30min，能消除背景颜色。 4 染色方法 可采用直接法、间接法等，与免疫荧光方法相似。 （二）酶联免疫吸附实验 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。 1 载体 聚苯乙烯微量滴定板最常用，有96孔、 40孔以及酶标条。 4 实验方法 直接法 用于测抗原 （如沙门氏菌） （1）待检抗原