第十一章微生物学新技术在环境领域中的应用讲述.ppt

不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。 当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。 一旦DNA 片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA 片段最低的解链区域解链，部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，不同的DNA 片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。 然而，当变性剂浓度达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。 在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。 含有GC 夹子的DNA 片段解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 胶中完全解链。 当加了GC 夹子后，DNA 片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。 当用DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用PCR 扩增的16S rDNA 产物来反映微生物群落结构组成。 通常根据16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物，其中一个引物的5’-端含有一段GC 夹子，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE/TGGE 分析。 由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片断，所以一般选择扩增16S rRNA基因的V3区或V6-V8区。 16S rDNA的高可变区 E. coli 16S rRNA二级结构及各可变区 V3区 约170bp V6-V8区 约350bp 片段大小不同，携带的信息量不同，选择不同的区域得到DGGE图谱不同，群落信息也有差异 不同的片段大小对应的胶浓度也不同 根据需要选择最合适的 提取基因组后，扩增16SrDNA高可变区片段 确定合适的变性剂范围 对DNA片段进行有效分离 根据变性剂梯度方向与电泳方向相同或不同,DGGE分为： 垂直DGGE 平行DGGE 常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况,只能有50%的检出率。 应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100 %。 当等长的双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时,因其解链的速度和程度与其序列密切相关; 部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小。 GC-Clamp 16SrDNA 低浓度 高浓度 DGGE的参数： 胶浓度 取决于片段大小 ，通常不宜超过500bp 6%胶浓度： 400 ～ 1000bp 8%胶浓度： 200 ～ 400bp 10%胶浓度：100 ～ 300bp 变性剂范围 不同的样品不同 温度 一般都用60摄氏度 电压 时间 环境样品分析的流程 DGGE在微生物分子生态学中的应用 对微生物群落结构进行对比、分析或者跟踪监测。 通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的 多样性。 跟踪及检测细菌的富集和分离，评价不同的培养 条件对分离菌种的影响。 举例： 油藏古细菌 V3区 DGGE 图谱 胶浓度：10% 变性剂范围：40%-60% 电压：200V 运行时间：4.5h 优点： 重现性强，可靠性高，方便快捷而且使用成本低。 能同时分析多个样品，使其非常适于分析环境样品 中微生物群落结构的变化。 缺点： 分辨率有限，复杂环境中（土壤或肠道），只能检测出优势菌。 一般只能分析500bp以下的片段。 PCR过程产生的异源双链和单链DNA会对分析造成偏差。 三、生物芯片 通过微加工技术和微电子技术将生物探针分子（寡聚核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等）固定在硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质表面，从而构建出一个微型生物化学分析系统。 生物芯片可以对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分进行准确、快速和大信息量的检测。 生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、基因组图谱、药物筛选、农作物选育、司法鉴定、食品卫生监督等多个领域。在环境检测领域，可以利用生物芯片技术快速检测微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害。 * 20条 第十章 微生物学新技术在环境领域中的应用 第一节 固定化技术 一、固定化酶和固定化微生物的定义和特点 固定化酶，通过物理吸附法或化学键合法将水溶性酶和固态的不溶性载体相结合，使酶