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三、色谱定性与定量方法 面积归一:Rg1=1.0%, Rb1=3.5% 外标法:Rg1=0.2%, Rb1=0.5% (1) 色谱定性分析 利用保留值及其规律定性 各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值,因此保留值可作为定性指标。 利用纯物对照定性 利用文献值对照定性(很少用) 纯物质对照定性 实现方法 利用保留时间和保留体积定性 用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性 应用范围:适用于简单混合物,对该样品已有了解并具有纯物质的情况。 优点:应用简便,不需要其他仪器。 缺点:定性结果的可信度不高。 提高可信度的方法:双柱、双体系定性 文献值对照定性分析 (GC) 实现方法 测定相对保留值ri,s 测定保留指数I 优点:无需纯物质;保留指数具有较好的重现性和精密度;只与固定相和柱温有关。 缺点:对结构复杂的物质,缺乏数据。 适用范围:适用于简单混合物,无需纯物质。 与其它仪器或化学方法联合定性 离线联用方式 在线联用方式 离线联用方式 收集方法:GC中一般采用液氮冷阱冷却后收集 应用范围:无标准物时,可对较为复杂的混合物进行定性分析 缺点:麻烦 在线联用方式 混合物经色谱分离后,将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有:GC-MS、GC-FTIR、LC-MS……,其它仪器相当于色谱仪的检测器。 使用范围:复杂样品的定性。 优点:不需要标准物,定性结果可信度高,操作方便。 缺点:需要特殊仪器或设备。 (2)色谱定量分析 定量基础 色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有: 定量要解决的问题 峰面积的测量和计算 校正因子的测量与计算 色谱定量方法及其应用 峰面积的测量与计算 积分仪 色谱工作站 简便、速度快,精度高,可达0.2-2%,对小峰及不对称峰的结果准确,是色谱发展趋势。 重叠峰的测量 切线分峰 垂线分峰 连线分峰 计算机拟合分峰 校正因子的测量与计算 相对校正因子 由于绝对校正因子与仪器的灵敏度有关,又由于灵敏度与实验条件相关,且每一检测器的灵敏度都是不同的,它不容易测量准确,亦无通用性,所以实际工作中使用相对校正因子。 相对校正因子的表达式 质量校正因子 摩尔校正因子 相对响应值 相对校正因子的测量 理论上相对校正因子与试样、标准物质、检测器类型、载气类型有关,与其它色谱条件无关。 无纯物质时或对结果准确度要求不高时,相对校正因子可通过查表得。 即无纯物,手册上又无数据时,可用一些计算方法估算这些物质的相对校正因子。 定量方法 校正归一化法 —— 含归一化 内标法 —— 含内标标准曲线法 外标法 —— 含单点校正 校正归一化法 应用范围:当试样中各组分都能流出色谱柱,且在检测器上均有响应,各组分峰没有重叠时,可用此法。 优点:简便、准确,当操作条件如进样量等变化时,对定量结果影响很小,该法适合于常量物质的定量。 缺点:对该法的苛刻要求限制了它的使用。 归一化法 若各组分的定量校正因子相近或相同,则上式可简化为: 内标法 推导 将一定量的纯物质作为内标物,加入到准确称量的试样中。 适用范围:当只需测定试样中某几个组分,且试样中所有组分不能全部出峰时可用。 优点:受操作条件的影响较小,定量结果较准确,使用上不象归一化法那样受到限制,此法适合于微量物质的分析。 缺点:每次分析必须准确称量被测物和内标物,不适合于快速分析。 内标标准曲线法 fi,sms/m为常数K,此时Ci%=K·(Ai/As),以Ci%对Ai/As作标准曲线。 优点:不必测校正因子,消除了某些操作条件的影响,方法简便,适合液体试样的常规分析。如白酒分析国标中采用此法。 外标法(标准曲线法) 用于常规分析 优点:操作简单,计算方便。 缺点:结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。该法必须定量进样。 单点校正 当被测试样中各组分的浓度变化范围不大时而用单点校正法。 即配制一个与被测组分含量十分接近的标准溶液,定量进样,计算被测物的含量。 定量中的误差问题 样品的代表性(样品的前处理) 进样系统的影响 柱系统的影响 测量误差 定量结果的误差分析 * * 人参药材的HPLC图谱 5 1 1 8 7 5 4 2 3 6 人参皂苷标准品的HPLC色谱图 Rg1 Rb1 Re 丙二酰基人参皂苷Rb1 GC-MS 被测组分的质量 标准物质量 分子量 推导:
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