HearNPVP26蛋白的结构解析.docx

HearNPVP26蛋白的结构解析关键词：HearNPV；P26；免疫相关；硒代甲硫氨酸；晶体结构；4.1 材料和方法4.1.1菌株，质粒和病毒大肠杆菌DH10B和BL21（DE3）均由本实验室保存。DH10B菌株用于克隆载体的构建，BL21（DE3）用于原核蛋白的表达。pET-32a(+)表达载体含硫氧还蛋白标签（Trx-tag），S标签（S-tag）和六连组氨酸标签（6×His-tag）。野生型病毒株HearNPV G4由本实验室保存。4.1.2 重组表达质粒的构建以HearNPV G4基因组为模板，用PCR扩增出截掉1-17位氨基酸信号肽的p26基因片段，扩增片段通过BamHI和HindIII酶切位点插入表达载体pET-32a(+)中，表达蛋白在N端融合了Trx-tag， S-tag和6×His-tag。将表达载体电转化进DH10B感受态细胞，菌液PCR鉴定出阳性菌落后，提取质粒进行测序鉴定。4.1.3 P26蛋白的原核表达与纯化将鉴定正确的表达载体电转化进BL21（DE3）感受态细胞，次日挑取单菌落接种于含50 ml LB培养基中，37℃过夜培养，次日将过夜培养物按1:100的比例接种于含1L LB培养基中，37℃培养2-2.5小时，待OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG在16℃下过夜诱导。诱导结束后5,000×g 离心 10 分钟收取菌体，菌体用50ml PBS重悬，1000 bar高压破碎菌体3个循环，将破碎液以100,000×g 高速离心 40 分钟分离上清和包涵体。将含有可溶性目的蛋白的上清与5 ml镍柱（Roche）孵育，PBS洗涤柱子以除去未结合的蛋白，用含20mM咪唑的PBS洗杂蛋白，最后用含300mM咪唑的PBS洗目的蛋白。由于表达的目的蛋白N端融合有Trx-tag和S-tag，为了避免标签对后续蛋白结晶的影响，需要将蛋白的标签除去。由于融合标签与目的蛋白之间存在Thrombin特异性酶切位点，因此可用Thrombin对标签进行切除。具体操作步骤如下：将目的蛋白用超滤管浓缩至1ml，然后用10ml 的Thrombin酶切缓冲液（50mMTris-Cl pH8.0, 100 mMNaCl, 2.5 mM CaCl2）置换目的蛋白中的PBS缓冲液；将蛋白浓缩至1ml，加入Thrombin（Sigma）7μl，混匀后在室温孵育1小时；将酶切后的蛋白样品上样Superdex-75柱，柱子平衡缓冲液为5 mMTris-Cl pH7.5, 300 mMNaCl, 20% glycerol。收集目的蛋白峰浓缩至16 mg/ml, 液氮速冻后于-80°C保存。4.1.4 P26蛋白的结晶筛选和优化采用坐滴气相扩散法对HaP26蛋白进行结晶，晶体的筛选选用Hampton Research公司的Screen和Cryos试剂盒，用96孔板进行晶体的培养。晶体初筛时，蛋白浓度设置为8和10 mg/ml, 液滴体积为0.8μl，含0.4μl蛋白溶液和0.4μl库溶液，池液体积为96μl。晶体板在16℃静止放置。约7天后观察到P26晶体，结晶条件分别为：Cryos试剂盒的93号条件（0.085 M HEPES pH 7.5，8.5 %(w/v) PEG 6000，4.25 %(v/v) MPD，15 %(v/v) Glycerol），Screen I试剂盒的17号条件（0.2 M Lithium sulfate monohydrate，0.1 M TRIS hydrochloride pH 8.5，30% w/v Polyethylene glycol 4,000）和Screen II试剂盒的26号条件（0.2 M Ammonium sulfate，0.1 M MES monohydrate pH 6.5，30% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000）。由于Cryos试剂盒的93号条件晶体分辨率很差，而Screen试剂盒两个条件的晶体质量较好，因此我们对这两个结晶条件进行优化，优化的参数为缓冲液的pH值和沉淀剂的浓度。对于17号条件，最终优化的条件为：0.2 M Lithium sulfate monohydrate，0.1 M Tris hydrochloride pH 8.3，32% w/v Polyethylene glycol 4,000，26号优化条件为：0.2 M Ammonium sulfate，0.1 M MES monohydrate pH 6.7，28% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000。4.1.6 硒代P26蛋白样品的制备目前还没有HaP26同源蛋白结构的报道，因此无