构建含肿瘤坏死因子关凋亡诱导配体基因慢病毒载体.doc

构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体 张 海，蒋正方，刘 阳，张 波，吴贵强，曾令勇(绵阳市第三人民医院神经外科，四川省绵阳市 621000) 文章亮点： 实验创新性采用大肠杆菌同源重组法构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体，并对其进行鉴定，发现该基因慢病毒载体的构建是方便可行的，包装体系也是成熟的，可为后续把肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体转导进神经干细胞进行基因治疗奠定基础。 关键词： 组织构建；组织工程；肿瘤坏死因子；相关凋亡诱导配体基因；慢病毒载体；重组质粒；PCR；Western blot 主题词： TNF相关凋亡诱导配体；基因；质粒；聚合酶链反应；印迹法，蛋白质 摘要 背景：腺病毒的表达时间有限，会限制目的基因的表达时间和表达量，不利于实验的持续进行，故文章选择慢病毒作为载体，与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。 目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。 方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列(NM 145681.1)，设计出该基因的特异性引物Trail-Age-F和Trail-Age-R，用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因，Age酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中，产生目的重组质粒，用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体，3个质粒共同转染293T细胞，产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒，收集病毒进行滴度鉴定，收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。 结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，全长861 bp，与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-mTrail在转染2 d后收集病毒液，经PCR和Western blot方法鉴定，从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×10 TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。 265-270. Construction of a lentivirus vector for Trail gene in rats Zhang Hai, Jiang Zheng-fang, Liu Yang, Zhang Bo, Wu Gui-qiang, Zeng Ling-yong (Department of Neurosurgery, the Third Hospital of Mianyang, Mianyang 621000, Sichuan Province, China) Abstract BACKGROUND: Adenovirus, expressing within a limited period, can limit the expression time and amount of target genes that is not conducive to ongoing experiments. Here, we select adenovirus as vectors for genetic recombination with tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (Trail) gene fragment. OBJECTIVE: To explore the construction of recombinant lentiviral vector carrying Trail in rats METHODS: The Trail gene was obtained: according to GenBank in rat Trail gene sequence (NM_145681.1), we designed the gene specific primers of Trail-Age I-F and Trail-AgeI-R, and used AgeI as enzyme cutting site. PCR was applied to amplify Trail gene from rat cDNA Library and construct recombinant plasmids after cutting Trail gene to be cloned into expression vector GV218