植物学_RNAi技在植物功能基因组学中的研究进展.ppt

RNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展 Interdaction RNA干涉(RNA interference,简称RNAi) 是指一些小的双链RNA(double strand RNA, dsRNA)可以高效、特异的阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。 RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。可以快速分析靶基因的功能，近年来发展迅速,已成为功能基因组研究和反向遗传学研究的有力工具。RNAi技术被《Science》杂志评为2002年度的十大科技突破。 Contents RNAi技术概述 1.1 RNAi的发现 1995年,康乃尔大学的Guo和Kempheus利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断线虫(C.elegans)中的par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA (sense RNA)相反的结果，但结果却令他们费解：二者同样阻断了par-1基因的表达途径。 1998年,Fire和Mello等首次将正义链和反义链的混合物注入秀丽新小杆线虫,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默(gene silencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。 1.2 RNAi的分子机制 外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内,产生一些dsRNA。胞质中的核酸内切酶Dicer将这些dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的短双链RNA(大约21~25 bp),即siRNA。 siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链,然后反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。 RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合,RISC具有核酸酶的功能,在结合部位切割mRNA, 被切割后的断裂mRNA随即降解。 RNAi信号的放大 siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在依赖RNA的RNA聚合酶(RNdependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。 1.3 RNAi作用的特点 高效性 研究发现RNAi过程中不同浓度的dsRNA产生的效果一样。Miki等研究水稻OsRac基因家族的功能时,通过构建单一基因片段的植物表达载体,成功地抑制了OsRac基因家族的多个基因。说明RNAi可实现在一个个体或一个细胞内同时沉默多个基因。 高度特异性 由dsRNA诱导的RNAi只引起与dsRNA同源的mRNA降解,不影响其它基因的表达,具有很高的特异性。 siRNA具有特征性的结构:5’末端为磷酸基,3’末端为羟基,并且有2个突出的单链核苷酸。这种结构对RNAi是十分必要的。 ATP依赖性 研究发现,如果除去或降低内源性ATP含量,dsRNA对靶基因的抑制作用明显降低或消失,加入外源性ATP后,抑制作用仍未加强。说明RNAi是一个对ATP依赖的过程,且外源性ATP对此无促进作用。 可传播性 在植物中,RNAi信号可以通过胞间连丝或维管组织在细胞间传递;而在动物中,RNAi信号的扩散需要特殊蛋白参与,在膜上形成跨膜通道而传播到整个机体。 可遗传性 RNAi效应可以稳定的遗传给子代,在子代的表现型呈孟德尔遗传方式。 Contents 转录后基因沉默（PTGS） 转录后基因沉默是最普遍的一种沉默机制。PTGS通过降解mRNA来抑制基因的表达。包括几种现象:一种现象是植物中的共抑制(co-suppress)现象,即引起外源基因和靶基因或内源基因同时发生沉默,首次在矮牵牛中发现此现象。此外病毒侵染植物引起基因沉默也属于共抑制现象。另一种是真菌发生静息现象(quelling)。 转录水平基因沉默（TGS） 它是由siRNA指导染色体发生变化(包括DNA和组蛋白甲基化)是指启动子序列发生甲基化或局部染色体发生变化,影响转录因子的结合,使基因不能正常转录,下调基因表达。 翻译水平上基因沉默 这个过程主要是由内源性miRNA介导的一种基因沉默。miRNA的前体(pre-miRNA)是70 nt的茎环RNA或双链RNA,它们在Dicer酶、ATP和解旋酶的共同作用下分裂成21~25 bp的成熟miRNA。成熟的miRNA是具有约22 nt的5’为单磷酸基、3’为羟基的单链RNA。miRNA与相关蛋白质