浙江大学生物化学实甲 -酵母蔗糖酶的提取原理.doc

酵母蔗糖酶的制备原理 一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介 蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包 酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。 酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。 二、酵母蔗糖酶的分离纯化 本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：缓冲液抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀， DEAE-Sepharose柱层析分离纯化。 前三步分离纯化的原理如下： ㈡、离子交换DEAE-Sepharose柱层析分离纯化的原理 离子交换柱层析分离混合物的基本原理 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的 阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。 离子交换层析是一种液-固相层析技术。其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素（二乙胺基乙基 a、缓冲溶液pH的选择： 决定于被分离物质的等电点、稳定性和溶解度及交换剂上交换基团的解离常 数（pK值）。若分离的目的物属酸性物质，用阴离子交换剂时，缓冲液要用高于该物质等点电的pH值，并且此pH值应低于该交换剂的pK值。反之若目的物属碱性物质，用阴离子交换剂时，则缓冲液应选用低于该物质等电点的pH值，并且此pH值应高于该交换剂的pK值。 b、缓冲液的离子种类及离子强度： 为降低盐离子的竞争，起始缓冲液的浓度应尽可能低（0.001～0.01M），当确认该物质能被吸附后，可适当提高离子强度，以提高缓冲能力。 缓冲液的离子应不影响被分离物质或干扰其活力的测定，也不应影响被测物质的溶解度或与一些必要的保护剂（Ca2+、Mg2+等）发生沉淀。洗脱液的梯度应可单纯增加缓冲液的离子浓度，但并不影响缓冲液的pH。 ⑶、层析柱的选择 柱床体积至少要比束缚所有样品所需要的大2～5倍，柱的形状一般以直径 与高度之比为1：15为好。 a、当采用阶段洗脱时，不能用过长的柱，否则区带扩散较宽，降低分辨率， 即应用直径与高度之比较高的柱。此时，如必须增加离子交换剂的体积，则应增加柱的直径。 b、当采用连续梯度洗脱时，则增加柱长能增加分辨率，但此时流速不能过快。 ⑷、装柱 柱装的好坏对层析效果影响很大，对装柱的要求是，交换剂在柱中分布要均匀，严防有节和气泡产生，沉积表面要平。 ⑸、柱的平衡 即用起始缓冲液充分洗涤柱床，已达到所需的pH及离子强度，以免在层析 中发生pH的变化。当达到充分平衡时，流出液和起始缓冲液的pH和电导度均应相同。 此步的另一目的还在于使柱床体积稳定下来即柱高不变和保持洗脱液流速的恒定。洗脱液流速的恒定可通过调节操作压或调节流出口内径的大小来控制，增大操作压或加大流出口内径，流速均加快。洗脱液合适流速的确定应根据实际情况而定，如果流速太快，则分辨率降低，每种物质的洗脱峰都要被其它物质所污染。如果流速太慢，则洗脱峰会扩散。 ⑹、上柱样品的准备与量的大小 样品应与起始缓冲液具有相同的pH和离子强度，上柱前样品应离心除去不 溶物，否则容易将柱堵住。上样量的大小取决于试验目的、样品中所要物质的浓度以及它对交换剂的亲和力。当所要物质在样品中含量很低，但对交换剂亲和力很大时，可以将几倍于柱床体积的样品通过柱，直到该成分饱和为止，然后再进行洗脱。当要求高分辨率时，加样时紧密吸附的区带不应超过柱床体积的10%。阶段梯度洗脱时，加样量可相应大一些，因为此时解吸和再吸附的过程是不重要的，但紧密吸附的区带也不应超过柱床体积的一半。 加样时注意不要把床表面破坏，否则层析区带会不整齐。如有破坏，可搅起数毫米交换剂，使其自然沉降平正为止。 ⑺、洗脱梯度的形状和吸脱液量的大小 吸脱液体积（相对于柱床体积而言）的大小和吸脱梯度的形状（盐浓度的变化能力）对柱的分辨率影响极大。洗脱可以用恒定组成的起始缓冲液来完成（简单洗脱），也可以用改变pH或盐浓度、或二者均改变的洗脱液来完成。pH和盐浓度的改变又分为连续改变（梯度洗脱）和不连续改变（阶段洗脱），由于pH的改变对生物大分子活性的影响很大，因此实际应用中常