质粒DNA的提取、纯化和电泳检测详解.docx

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测 摘要 本实验通过碱变性法提取E.coli DH5α（pUC19）的质粒DNA,并且通过一系列的分离纯化技术将其质粒DNA与染色体DNA、RNA、蛋白质等杂质分开从而得到纯化的质粒DNA分子。通过琼脂糖凝胶电泳可以通过DNA条带的位置来大致判断其分子大小，也可以将实际电泳的结果和理论结果相对比，分析差异产生原因，从而完善实验方法，严谨实验步骤。 关键词碱变性法分离纯化技术琼脂糖凝胶电泳 引言 质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。质粒在基因工程中是一类重要的载体，其作用主要是携带一些基因片段（可以是编码基因,也可以是调控区等），在细胞内环境中进行表达或参与通路的相互作用，通过将质粒转化到宿主细胞可以探究基因相互作用关系，取得蛋白产物，实现特定基因片段的克隆等。总之，质粒在生物科学研究方面具有广泛的作用。 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用。碱裂解/碱变性法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的分离方法。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA恢复原来的构型，保存在溶液中；染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来，通过离心被除去。最后，质粒DNA用冰乙醇沉淀获得。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 电泳（electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶电泳是分子生物学的核心技术之一。凝胶是电泳支持介质，具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，此时移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段。 正文 1.材料和方法 1.1材料和试剂 实验材料：E.coli DH5α（pUC19）。 实验试剂：LB液体培养基、氨苄青霉素（Amp）母液（储存浓度100mg/mL）、溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mM EDTA (pH 8.0）；溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1% SDS；溶液Ⅲ：5MKAc（pH 4.8）；TE溶液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA (pH 8.0)；冰乙醇、70%乙醇、RNase A、Tris饱和酚、氯仿/异戊醇混合液、酚/氯仿/异戊醇（PCI）（25：24：1）混合液、3M NaAc溶液、灭菌双蒸水ddH2O、50×TAE缓冲液、10mg/mL溴化乙锭（EB）溶液、6×上样缓冲液（6×loading buffer）。 1.2实验方法 1. 大肠杆菌的增值 用牙签从LB固体培养基挑取E.coli DH5α（pUC19）菌落于LB+Amp（Amp工作浓度为100μg/mL）液体培养基中，置于37℃、200rpm培养箱下振荡过夜培养。 2. 实验前准备 （1）用搪瓷杯取一杯冰。 （2）将小烧杯放在天平上，调至平衡。 （3）配置80ml溶液Ⅱ: 将原液10M NaOH，10% SDS配制成0.2M NaOH，1% SDS。取用8ml SDS，1.6ml NaOH和70.4ml蒸馏水配置。 3. E．coil菌株的收获（ 4°C操作） （1）取一个灭菌离心管，称重，标记为W1 14.552g; （2）倒入菌液至距瓶口1/3处，两两配平； （3） 6000rpm，离心5min，弃上清； （4）加入5ml 溶液Ⅰ，涡旋， 6000rpm，5min，弃上清，称重为W2 14.676g，计算W2-W1 0.124g。 4.细胞裂解提取质粒DNA （ 4°C操作） 向菌体沉淀中量加入（按菌体量接近的重