胆红素试剂的探讨讲述.docx

胆红素试剂的探讨发布时间02年11月08日 14时11分四川迈克科技有限责任公司 赵瑜 周方银胆红素测定是临床上常用的检测项目，作为肝功能诊断的重要指标，对临床胆红素分析的质量控制值得我们重视。但直到今天，国内总/直接胆红素测定的标准化依然是临床化学分析的一道难题，尤其是直接胆红素分析。分析原因除了目前国内尚缺乏合格的商品参考物或校准品外，还有一个重要的因素就是试剂。不同方法学的试剂其准确度、精密度、测定线性范围、稳定性及抗干扰性等直接决定了临床结果的可靠性。目前胆红素测定方法根据类型可分为高效液相色谱法（HPLC）、导数分光光度法、直接分光光度计法、经皮胆红素测定法（TCB）、重氮法、氧化法等。临床常用商品试剂为重氮法及氧化法。重氮法包括改良J-G法、二甲亚砜法（DMSO法）、二氯苯重氮盐法（DPD法）、2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法（2，5DCB-4FB法）、改良2，5DCB-4FB法等；氧化法包括氧化酶法、化学氧化法，其中化学氧化法又有钒酸盐氧化法、亚硝酸盐氧化法、过硫酸盐氧化法、综合氧化剂法、复合有机包结氧化法等之分。HPLC法可从样品中同时分离出胆红素各组分，包括非结合胆红素（Bu）、胆红素单葡萄醛酸酯（mBc）、胆红素双葡萄醛酸酯（dBc）、δ胆红素（Bδ）、以及光照射后产生的光胆红素，并加以准确定量，该法灵敏度高、特异性强，是目前胆红素测定的最可靠方法。但该法仪器昂贵，技术要求高，在梯度浓度有机溶剂中各组分吸光系数的波动等问题也有待解决。导数分光光度法可消除血红蛋白、β-胡萝卜素的干扰，但该法不能测定Bc（结合胆红素或直接胆红素），样品和标准需预稀释，不适合临床大批量样品自动化分析。直接分光光度计法是专用于新生儿血清总胆红素测定，采用双波长比色避免溶血干扰，方法简单，不需要样品空白，但该法不适合自动化大批量分析。经皮胆红素测定方法（TCB）具有操作简单、非损伤性等优点，特别适用于婴幼儿及新生儿黄疸筛查，但该法影响因素多，不能完全代替血清总胆红素测定。在各种重氮试剂法中，改良J-G法为推荐方法，其灵敏度、准确度和特异性均较高，但显色时间相对较长；测定直接胆红素时需要严格控制时间（1分钟），用手工或半自动分析仪操作相对误差较大是其不足，在一些自动分析仪上使用也不方便。目前J-G法国内外均有不少商品试剂盒，但所接触的商品试剂盒稳定性尚存在一些问题，血红蛋白＞3.5g/L时，干扰较明显，对严重脂血抗干扰性也较差。DMSO法的最大优点为反应时间短，呈色后稳定性极佳（可稳定近2小时）、对脂血抗干扰性较强，受溶血干扰较轻，但血红蛋白＞3.5g/L时依然有较大的干扰，只能测定总胆红素。DPD法商品试剂多为干粉/冻干品单一试剂，复溶后保存时间较短，在自动生化分析仪使用不方便。该法测定总胆红素呈色为红色，易受溶血的干扰，对脂血的抗干扰性较好。2，5-DCB-4FB法商品试剂为液体双试剂，重复性好，但易受溶血的干扰；经改良的2，5-DCB-4FB法对溶血的抗干扰增强（Hb≤5g/L），但该法易受尿蓝毋干扰，试剂开瓶稳定性不及氧化法。氧化酶法是胆红素测定较好的一种方法，由于胆红素氧化酶（BOD）在碱性环境中可氧化所有胆红素成分，包括大部分（＞85%）的Bδ，这一特性可用于总胆红素测定；而在酸性条件下，mBc、dBc和大部分Bδ均被氧化，只有Bu不被氧化，这一特性可用于Bc（结合胆红素或直接胆红素）的测定；故可根据不同胆红素反应的最适pH差别，可分别定量测定总/直胆。该法特异性强、灵敏度高、重复性好，对溶血、脂血等抗干扰性强，操作简单，适用于自动化测定等。但该法所涉及的工具酶价格昂贵，故商品试剂价格昂贵。同时在酶法测定中胆红素氧化酶容易受到血清蛋白，尤其是白蛋白的影响，这主要由于作为底物的胆红素在掺入血清白蛋白的α螺旋链时，底物便不能接近酶分子中的活性中心（这一现象称为立体障碍）。从这一点考虑，也可推测与血清白蛋白结合的δ胆红素在保持白蛋白α螺旋链的pH范围内对胆红素氧化酶的作用有抵抗性。自1990年日本学者Kondo向欧洲的专利中提到：低分子量的无机氧化剂、过渡元素等在一定条件下都可氧化胆红素，因而可用来开发测定胆红素的方法后，化学氧化法开始得到长足发展。在化学氧化法中，反应分子与酶不同，属小分子，因此δ胆红素立体障碍所致的反应降低，与重氮法反应程度相类似，相关性良好，这也是开发化学氧化测定试剂的原因。在化学氧化法中，总胆红素测定需要选择适合的氧化剂、反应促进剂、非特异反应抑制剂、抗干扰剂；而结合胆红素的测定来在反应体系中还必需具有非结合胆红素反应抑制剂和吸收剂。近年国外学者在这方面做了不少报道。1993年日本和光株式会社KuniakiTokuda等率先开发出商品钒酸盐胆红素氧化法试剂，并在临床推广应用，它继承了氧化酶法的抗溶血、抗黄疸