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胰岛素氨基酸序列的测定讲述
桑格法测定氨基酸顺序
桑格试剂
2,4-二硝基氟苯(DNFB)
DNFB与氨基结合牢固,不易被水解,因此当DNFB-多肽被酸完全水解以后,原来的N-端氨基酸成为黄色的DNFB-氨基酸。然后通过纸层析法与标准样品比较,便可知道N端氨基酸的种类。
基本步骤
首先让FDNB与胰岛素反应,再用盐酸完全水解胰岛素以后,两种氨基酸被FDNB标记:甘氨酸和苯丙氨酸。由此推测出胰岛素是由两条肽构成。通过其他分析方法,测出了A链由21个氨基酸组成,N-氨基酸为甘氨酸;B链由30个氨基酸组成,N-氨基酸为苯丙氨酸。
上面的方法只能知道肽链N-氨基酸的种类。
后面通过氨基酸的DNFB标记和盐酸的不完全水解,来继续研究肽链的氨基酸序列:一条肽链被DNFB标记后,盐酸处理肽链,使其变成长度不等的各种短肽。通过电泳等方法使带有标记的不同长度被标记的肽链分离开来,并分别对分离出的各种短肽做组分分析。如果只有一种氨基酸A,那么就是N-氨基酸为A;如果有两种氨基酸A、B,那么肽链就为A-B,如果有三种氨基酸A、B、C,那么肽链就为A-B-C;如果有四种氨基酸A、B、C、D,那么肽链就为A-B-C-D…以此类推。用此方法,桑格得出了胰岛素A链的氨基端排列顺序为Gly-Ileu-Val-Glu-Glu,B链的氨基端排列顺序是Phe-Val-Asp-Glu。
DNFB-
DNFB-
DNFB-
DNFB
DNFB-
DNFB-
DNFB-
上面的方法虽然能测出肽链一定的顺序,但是只能测定很短的一段。
于是再次改变方法,先用盐酸处理肽链,使其分离成不同长度的肽段,并用每种肽段进行分离提纯。然后对每一肽段进行上一过程的操作,从而得到每一肽段的氨基酸排列顺序。再根据肽段重叠的部分进行组合,得到长肽链的序列。
上述几种步骤的重复,最终测定出了胰岛素的所有氨基酸顺序。
图2 对其中一个片段的分析
参考文献
[1]F.SANGER , H.TUPPY. The Amino-acid Sequence in the Phenylalany1 Chain of Insulin
[2]F.SANGER. The Free Amino Groups of Insulin.
[3] Ryle A P, Sanger F, Smith L F, Kitai R.The disulphide bonda of insulin.
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