胶体金试纸条的制备分析讲述.ppt

免疫胶体金技术简介 Immune colloidal gold technique 2015-1-27 胶体金免疫层析（Gold Immune – Chromatographic Assay, GICA）技术是结合了胶体金技术和免疫层析技术发展而来的，其本质为一种固相反应的 ELISA,并用胶体金来代替底物显色。 免疫胶体金技术 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。 胶体金标记 实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。 胶体金技术的发展 1939-----雏形 Kausche等把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度。 1971------作为标记物应用于免疫组织化学研究 Faulk等首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门菌的表面抗原。 1974------实现间接免疫金染色法 Romano将胶体金标记到马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法 胶体金技术的种类及优点 快速免疫金渗滤法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫测定。 主要由两部分组成：膜渗滤装置和标记结合物。前者为一塑料小盒，其中填满吸水性物质，面上紧贴放置一片吸附有抗体(以双抗体夹心法测抗原为例)的硝酸纤维膜，标记结合物为免疫金。 免疫胶体金技术的特点 优点： 检测方法简单而快速，数分钟即可得出结果； 不需仪器设备，操作人员不需特殊训练； 试剂稳定，适用于单份测定； 无污染； GICA的特点是单一试剂，一步操作。小型实验室即有条件开发生产。 干燥包装的试剂可在室温保存一年以上。?? 最近由于原料的精选和制作工艺的改进，已能制备出可用于定量测定的GICA试剂。Roche公司生产的用于急性心肌梗死诊断的肌钙蛋白和肌红蛋白的GICA试剂和匹配的简便测读器Cardiac Reader，其精密度和准确性均符合定量测定要求。 胶体金的合成 ①白磷还原法(1905年)可合成3nm左右大小的金颗粒； ②白磷还原法(1925年)经改良后，可合成5～12nm大小的金颗粒； ③抗坏血酸还原法(1958年)可合成6～13nm大小的金颗粒； ④柠檬酸三钠还原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金颗粒； ⑤乙醇—超声波还原法(1980年)可合成6～10nm大小的金颗粒； ⑥硼氢化钠还原法(1982年)可合成3—17nm大小的金颗粒； ⑦单宁酸—柠檬酸三钠还原法(1985年)可合成3～17nm大小的金颗粒。 胶体金合成 将100ml的0.1％H2AuCl4加入200ml的锥形瓶中，并将其置于搅拌电热炉上，加入一个磁力条并将溶液加热至沸腾。 向沸腾的溶液中加入1.5ml的0.1％二合水柠檬酸三钠，Na3C6H5O7.2H2O 当获得深红颜色的溶液时停止加热 注意事项（1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 胶体金的质量鉴定 金标样本程序 将胶体金调整至正确的pH值 确定最小蛋白含量 最终结合（标记） 纯化 胶体金调整正确的pH值 胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。 需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1N HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可. 最小蛋白用量的确定 （1）光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml），分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。