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荧光测定维生素c讲述
荧光分析法测定维生素 C
维生素 C及维生素C 的测定原理
荧光分析法测定维生素 C实验
荧光分析法测定维生素 C 应用
讲解人:贺政轩
一、维生素 C及维生素的测定原理
1.1维生素C
维生素 C 又名抗坏血酸, 是维持机体正常生理 功能的重要维生素之一,而人体不能自身合成 ,只能 从食物和药物中摄取,因此 ,食品、药物中维生素 C 的分析具有重要意义。
1.2维生素C测定方法
维生素 C 的测定常用的方法有光度法 、 电化学法、滴定法、酶法、色谱法等。 本实验提出了一种新的测定维生素 C 的荧光 分析方法:维生素 C 被 Cu2 +氧化为脱氢 抗坏血酸,再与苯甲酸及十六烷基三甲基溴化铵产生荧光协同增敏作用,通过对体系荧光强度的测定进行维生素 C 的定量分析。
二、荧光分析法测定维生素 C实验
1实验
1. 1 主要仪器与试剂
?
分子发光仪 :LS - 55 型
? 酸度计 :pH - 211型
榨汁机 :CW - JE04型
? 电热恒温水浴锅 :HH. SY11 - N i1型
? CuSO4溶液 :2. 0 ×10- 3 g m/ L
? 十六烷基三甲基溴化铵 (CTMAB )溶液 :6. 0 × 10- 4 g /mL
苯甲酸溶液:1. 0 ×10- 4 g m/ L
维生素 C 标准储备液 :5. 0 ×10- 4 g /mL, 2 ~ 8℃ (避光保存);
? 维生素 C 标准溶液 :1. 0 ×10- 5 g /mL, 2 ~ 8℃ (避光保存);
? NaOH -邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液:pH =6. 0;
1. 2 实验步骤
?
(1)配置待测样品及空白对照
在 25 mL 比色管中依次加入 0. 6 m L CuSO4 溶液,2. 0 m L十六烷基三甲基溴化铵溶液,2. 0 m L 苯 甲酸溶液 ,一定体积的维生素 C 标准溶液 ,5. 0 mL NaOH -邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液, 用蒸馏水定容,摇匀;以不含维生素 C 溶液为 空白对照。
(2)水浴加热
在 35℃恒温水浴中加热 30 m in, 将溶液流水 冷却至室温 。
(3)荧光分析
将待测样品放置于样品架上,设定激发波长为 308 nm ,发射波长为 408 nm ,测量荧光强度 F ,以不含维生素 C 的试剂空白为 F0 ,计算 F测 =F - F0 。
2 结果与讨论
?
2. 1 激发光谱和发射光谱
?
取 3. 0 mL 维生素 C 标准溶液, 按实验方法进 行操作,分别在 290 ~ 330 nm、360 ~ 460 nm 内扫描 得到激发光谱和发射光谱如图 1、图 2所示。从图 1、图 2中可看出 ,当激发波长为 308 nm , 发射波长 为 408 nm 时体系的荧光强度最大,试剂空白的荧光 值比较低且稳定, 故本实验选择激发波长为 308 nm ,发射波长为 408 nm 。
?
1— C u2 + +BA +缓冲溶液 +CTMAB; 2— Cu2 ++BA +维生素 C +缓冲溶液 +CTMAB
1— C u2 + +BA +缓冲溶液 +CTMAB; 2— Cu2 ++BA +维生素 C +缓冲溶液 +CTMAB
激发光谱
发射光谱
2. 2 试剂加入顺序
?
按照实验方法操作, 在各试剂加入量相同的情况下, 试验了试剂的不同加入顺序对荧光强度的影 响。试验结果表明, 当所加试剂顺序依次为 CuSO4 溶液、苯甲酸溶液、维生素 C 标准溶液、NaOH -邻 苯二甲酸氢钾缓冲溶液时 ,体系的荧光强度最大,因此选用此加入顺序为最佳试剂加入顺序。
2. 3 缓冲溶液
溶液的pH值对体系荧光强度有较大的影响,试验了不同的pH值对荧光强度的影响。由pH值 —荧光强度的曲线可知 , 当 pH 值为 5. 9 ~ 6. 2 时 ,荧光强度达到最大值且比较稳定 ,因此确定最佳 pH 值为 6. 0。
缓冲溶液的种类对体系的荧光强度也有一定的影响。试验了以下几种 pH 值为 6. 0 的缓冲溶液 :
NaOH - KH 2 PO4 、KH2 PO4 - 硼砂、KH2 PO4 - Na2 H PO4 、NaOH - 邻苯二甲酸氢钾、Na2 H PO4 - 柠檬 酸、NaOH -柠檬酸钠、HA c - NaA c等。试验结果表明 ,当所加的缓冲溶液为NaOH -邻苯二甲酸氢钾时,荧光强度最大且稳定。因此本实验选择NaOH - 邻苯二甲酸氢钾为缓冲溶液 ,其最
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