生物药物分析与检验酶分析法课案.ppt

酶偶联测定法：是应用过量、高度专一的 “偶联工具酶”使被测酶反应能连续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。 被测反应 偶联指示反应 ① 被测反应 肌激酶 辅助反应 丙酮酸激酶 指示反应 乳酸脱氢酶 ② 二、荧光分析法 三 华勃氏呼吸仪检压法 四、放射性同位素测定法 华勃氏微量呼吸仪（瓦氏呼吸仪） 五 电化学法（electrochemical） pH测定法：用高灵敏度的pH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用pH的变化来测定酶的反应速率。 离子选择电极法：测定某些酶的酶活力，用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应，如葡糖氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。 第二节 酶法分析 一、终点测定法 二、反应速度法 一、原理 是在以待测物质为底物的酶反应中，如果能使底物能够接近完全地转化为产物，而且底物或产物又具有某种特征性质，通过直接测定转化前后底物的减少量，产物的增加量或辅酶的变化就可以定量待测物——平衡法 一、基本概念 7.酶的活性单位（国际单位U）：在25℃及最适条件下，每分钟能转化一个微摩尔(μmol)底物的酶量定为一个活性单位。 8.酶的比活性：为一毫克(mg)酶的活性单位数目。 国际酶活力单位 1961年,国际生物化学协会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”(U)来表示酶活力，规定为：在最适反应条件(温度25℃)下，每分钟内催化1微摩尔(umo1)底物转化为产物所需的酶量,定为一个酶活力单位，即 1 U = 1 umol／min。 酶的比活力(specific activity) 比活力:每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示， 比活力=活力U／mg蛋白=总活力U/总蛋白mg 有时用每g酶制剂或每m1酶制剂含有多少个活力单位来表示(U／g或U／ml)。 比活力大小的含义：可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。比活力愈大，表示酶的纯度愈高。 活力单位(U)与比活力 U＝速度单位 每小时催化1克底物 每小时催化1ml某浓度溶液 每分钟催化1ug底物 酶产品质量评价中常使用比活力 单位质量酶产品中酶活力称比活力。 u/mg酶蛋白 u/ml酶蛋白 国际单位（IU）：在实验规定的条件下（25℃，最适pH、最适底物浓度时），1ul标本，以每分钟能催化1微摩尔底物的酶量为1个国际单位。 酶促反应速度的测定方法 产物浓度变化曲线 提问：为什么反应速度会随时间减小？ 答案：1.[S]降低； 2.酶受到产物抑制 提问：用哪一个速度来表示该酶促反应的速度特征呢？ 反应初速度 Vo 反应初速度表示酶活力。 提问：仅用反应初速度大小对比酶活力行吗？ 答案：不行，还与酶的加入量及条件有关。 酶活力测定实例 首先 确定反应条件 20℃、pH=7，底物浓度 6g/l（过量），加入2mg固体脂肪酶 第二 确定活力单位 如每小时催化1克底物 1u= 1g/h 第三 测算反应初速度 作产物甘油随时间增加的曲线，量出反应初速度值 ，换算为脂肪的消耗速度 如 8g/h 第四 换算活力 8g/h / 1g/h=8u 第五 计算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白 脂肪 脂肪酶 甘油 + 脂肪酸 二、酶促反应的条件 基本要求： 反应系统中除了待测酶的浓度是影响速度的惟一因素外，其他因素都处于最适于酶发挥催化作用的水平。 确定反应条件时应考虑： （1）底物 选用的底物在物理化学性质上和产物不同。 一般选用底物的浓度[S]=100 Km 一般选择Km小的作测定的底物。 （2）pH值 注意选择适宜的反应pH值，并将反应维持在这一pH值。 例：丙酮酸 乳酸 乳酸脱氢酶 pH对酶反应的影响 pH影响酶活力的原因 (1) 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。 (2) 当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。 影响了底物的解离状态； 影响酶分子活性部位上有关基