细菌的革兰氏染色解题.ppt

* * * * * * * * * * * * 革兰氏染色法 目的要求 学习并掌握革兰氏染色的方法 实验材料 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌。 染料：草酸铵结晶紫液、革兰氏碘 液、95%乙醇、番红液（沙皇复染液） 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒 精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲 苯等。 基本原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。 1884年由丹麦医师Gram创立。 实验内容 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡 萄球菌分别进行革兰氏染色。 对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进 行革兰氏染色。 经碱性染料结晶紫染色 经碘液媒染 用酒精脱色 有的细菌紫色不被脱去——（G+）， 有的可被脱去——（G-） 步骤 脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。 阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。 有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应（G+） 弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应（G-） 革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。 革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。 与细菌细胞壁的化学组成及结构有关 革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水，肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。 革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质，使细胞壁通透性增加，结晶紫——碘复合物易被抽出，于是被脱色。 阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。 方法与步骤 涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色（1min）→水洗→路哥氏碘液媒染（1min）→水洗→95%乙醇脱色（30s）→水洗→番红复染（1min）→水洗→干燥→镜检。 制 片 取一片载玻片，在中央滴一小滴生理盐水，用接种环以无菌操作，从单个菌落中挑取少量的菌于生理盐水滴中，混匀并涂成薄膜 干 燥 涂面朝上，瞬间通过火焰2-3次，使生理盐水完全干。 初 染 在菌膜上滴加结晶紫染色1分钟，用蒸馏水进行冲洗（不要正对着菌膜冲，以免将细菌冲掉），至无紫色液体流出。 固 定 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜1分钟，对结晶紫染色进行巩固，之后用蒸馏水对其进行冲洗，至无颜色流出为止。 脱 色 将玻片倾斜，用滴管吸95%的酒精进行冲洗脱色30秒，立即用蒸馏水冲洗。 复 染 用沙皇复染液对其进行复染1分钟，用蒸馏水冲洗。 镜 检 用滤纸将水吸干，滴1滴香柏油在菌膜中央，用油镜观察。 严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。 菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应 关键点 大肠杆菌（G-） 枯草芽孢杆菌（G+） 金黄色葡萄球菌与大肠杆菌 实验思考题 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌染色后，是G-还是G+？ 为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄有所要求？ 你的实验结果与与培训中所述是否一致？如果不一致，试分析原因。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *