蛋白质层析分离纯化技术讲述.ppt

准备 HiTrap? Chelating 柱 冲洗 5 ml H2O 加 0.5 ml 0.5 M NiSO4 冲洗 5 ml H2O 用 5-10 ml 20 mM Tris? -HCl, 5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8 结合缓冲液洗柱 最多 5 分钟 * 纯化和复性 稀释样品, 用 10 ml 结合缓冲液洗柱，5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍, pH 8.0上样，并以 20 mM咪唑, 6 M 尿素 pH 8.0 缓冲液洗柱 复性 线性梯度：~ 6 to 0 M 尿素  最少 30 柱体积 流速： 0.1 ml/min - 1 ml/min 用没有尿素缓冲液冲洗 5 个柱体积 纯化和洗脱 线性梯度: 20 mM - 500 mM 咪唑 10 - 20柱体积 用 HiTrap Desalting 交换缓冲液去除咪唑 1.0 0.75 0.5 0.25 0 10 20 30 40 50 60 65 ml Manually using a syringe: ? Sample loading ? Gua-HCl wash ? Urea wash Start elution fr. 38 fr. 42 fr. 46 fr. 49 fr. 40 Start refold- ing A 280 * 组份分析 1: LMW 2: 样品 3-6: 盐酸胍冲洗物 7, 8: 尿素冲洗物 1: LMW 2-6: 组份 38-42 7,8: 组份 48, 49 1.0 0.75 0.5 0.25 0 5 10 15 20 ml A 280 kD94 6743 30 20.1 14.4 1 2 3 4 5 6 7 8 kD94 6743 30 20.1 14.4 1 2 3 4 5 6 7 8 Superdex? 75 HR 10/30 SDS PAGE PhastGel? Gradient 10–15 样品稀释前处理:　 用 15% SDS, 30% 2-巯基乙醇 +10 mM Tris+1 mM EDTA稀释1:5 HiTrap Chelating 1 ml Superdex 75 HR 10/30 * 多维蛋白质纯化 * 高效纯化策略 粗提 纯化 精细纯化 载量 速度 分辩率 回收率 * 减少处理步骤 得率 (%) 95% / 步 90% / 步 85% / 步 80% / 步 75% / 步 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 步骤 * 准备工作 考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济 蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点 * pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变 滴定曲线 蛋白质净电荷 1 2 10 稳定性范围 用阳离子交换 用阴离子交换 3 pH 不同 pH 下的分离情况 2 1 + - * pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变 流动相的 pH 选择性 V V V 阳离子 阴离子 pH 0 + - V V V V V Abs Abs Abs Abs 表面净电荷 Abs Abs Abs Abs * 样品准备 考虑: 根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 稳定样品 * 三步纯化策略 Step 纯度 粗提 中度纯化 精细纯化 样品准备, 萃取, 净化 达到最高纯度 去除大部分杂质 分离, 浓缩 和稳定样品 * 三步纯化策略 步骤 粗提 精细纯化 层析填料的 颗粒大小 中度纯化 * 三步纯化策略 步骤 粗提 精细纯化 流速 中度纯化 * 三步纯化策略 步骤 粗提 精细纯化 分辩率 中度纯化 * 粗提 目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析 分辩率 快速 回收率 载量 * 粗提: 离子交换填料 预装柱 20ml 颗粒大小 流速 HiPrep? 16/10 Q XL SP XL 90 μm 10 ml/min HiPrep 16/10 DEAE CM 90 μm 10 ml/min Sepharose? Big Beads STREAMLINE? Sepharose? Fast Flow * 粗提: 疏水层析填料 高载量 高流速 HiPrep? 16/10 Phenyl (高 低取代) HiPrep 16/10 Butyl HiPrep 16/10 O