6第6章沉淀反应课案.ppt

;第六章 沉淀反应;第三节　凝胶内沉淀试验 一、单向扩散试验 二、双向扩散试验 第四节 免疫电泳技术 一、对流免疫电泳 二、火箭免疫电泳 三、免疫电泳 四、免疫固定电泳 ;第一节 沉淀反应原理及特点;形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物　　;免疫浊度测定 絮状沉淀试验;第二节　液体内沉淀试验 ;絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。 方法受抗原抗体比例的影响非常明显 应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型);抗原稀释法：抗原最适比例;表6-1 最适比方阵测定法; 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度??利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。 ;1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力　　　　　　　强并使用R型抗体 3.抗原抗体反应液的最适PH为6.5～8.5 4.使用增浊剂;1.透射免疫比浊法 2.散射免疫比浊法 3.免疫胶乳比浊法 ;第三节　凝胶内沉淀试验; 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。;原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。 环的大小与抗原的浓度成正相关。;抗体+琼脂;沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法;　　 T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线 ;影响因素： 抗体质量 标准曲线 ，质控血清 结果与真实含量不符 　单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高 双环现象 　不同扩散率抗原性相同的两个组分 ; 原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。 ;应用;应用;应用;第四节　免疫电泳技术;优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 　　3.增加了分辨率。 　　　;原理：双向扩散 + 电泳 比双向扩散试验灵敏度提高8～16倍;通电;结果分析： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。 沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度＞抗原，反之，则是抗体浓度＜抗原浓度。;电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。 ;1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。;1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。 2.电泳终点时间的确定。3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。 ;;原理：区带电泳＋双向扩散 1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。 ;纯化抗原和抗体成分的分析及正常和 异常免疫球蛋白的识别与鉴定; ;免疫电泳原理，不同之处是将抗血清直接加于电泳后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型 　;先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将IgG、IgA、IgM、κ轻链和λ轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带对照，作用一定时间后洗去游离蛋白质，染色后则可见被固定的相应M蛋白成分。 ;　左图为IgG κ型, 中图为IgG λ型，右为正常 ;分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。 ;1.主要用于血液、体液中蛋白质的测定。 2.优点：稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染，适合大批量标本检测。3.对流免疫电泳与火箭免疫电泳技术由于电渗的缘故已不推荐使用。 4.免疫电泳扩散时间长，影响因素多，结果不易分析。 5.免疫固定电泳分辨力强，敏感度高，结果易于分析，常用于M蛋白的鉴定与分型。 ;1.什么是沉淀反应？ 2.沉淀反应的特点？ 3.免疫浊度法的原理、方法与分类？ 4.单向???散试验的原理和应用？ 5.免疫