怎样选择色谱柱_液相色谱柱的种类与方法开发解题.ppt

液相色谱柱的选择和方法开发 奥秘科技/AUMI Technologies （US） 内容概要 色谱基本概念回顾 色谱柱类型、选择和方法开发 色谱基本概念回顾 色谱（chromatography） 色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池） 分离度 Rs - Resolution N – Theoretical Plate Number α– Selectivity k – Retention Factor 拖尾 1.Separation of Compounds A and B 灵敏度 ＬＯＤ：Limit of Detection ＬＯＱ：Limit of Quantification 　－ 柱效 　　－峰形（拖尾因子） 　 重现性 分离度（Ｒ） 　－保留时间（Ｖ，Ｔ，Ｋ） 　－选择性（ α） 　－柱效　（Ｎ） 灵敏度 　 色谱柱类型、选择和方法开发 色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响 分离度《 - 选择性 〈 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 - 柱效 〈 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速 峰对称性《 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积《 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 灵敏度《 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性《 基质表面特性，键合类型；流动相，温度 流动相 《 pH，缓冲盐种类，溶剂； 影响色谱柱性能的主要因素 1、 色谱柱的构型 色谱柱内径 色谱柱长度 2、 固定相柱填料 粒径 比表面积 孔径 孔隙率 基质表面特性： - 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响 色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径 色谱柱尺寸 对色谱分离的影响： ? 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 ? 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 ? 窄径柱 (? 2.1mm) – 满足检测器和样品量限制 ? 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命 制备柱 (内径 10 mm) – 用于纯化制备 柱填料对色谱柱性能的影响 柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径 硅胶粒径和类型对柱效的影响 d 硅胶粒径和类型对压力的影响 柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II 目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 5.0μm － 常规分析 颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高. 柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积 每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积 柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I 多孔材料的95%以上表面在孔内部 样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部 孔径至少是样品流体学直径的4倍 300?孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸 样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部 柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II 由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大 条件： C8色谱柱，4.6×150mm， 3.5um， A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－ 水中； 20min梯度，10 30%B；60°C， 1.5ml/min 柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I 2.3-二羟基萘 2.7-二羟基萘 TF=1.31 Brand W, AQ Column 5μm, 4.6mm×150mm Brand Z,C18 Column