《诊断学》 第一节 基因诊断.pdf

1 第一节 基因诊断 分子生物学是当前生命科学中发展最快并正在与其他学 科广泛交叉与渗透的重前沿领域。近年来分子生物学理论和 技术不断应用于临床，在疾病的诊断、治疗和预防等方面发 挥了重要的作用，并显示出了无限的潜力。分子生物学与临 床医学的广泛交叉和渗透就产生了分子医学。20 世纪 70 年代 末，美国科学家 Kan 等首次应用 DNA 分子杂交技术成功地对 镰形细胞贫血症进行了基因诊断，这标志着基因诊断的开始。 一、基因诊断的含义 基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断。 它是以遗传物质（如：DNA 或 RNA）为检查对象，利用分子 生物学技术，通过检查基因的结构或表达量的多少来诊断疾 病的方法。这里的遗传物质既可是外源性基因（如侵入机体 的病毒、细菌、支原体等病原微生物的基因），也可以是内源 性的基因（如癌基因、抑癌基因或突变的基因等）。因此基因 诊断（分子生物学诊断）主要是对遗传物质结构改变与否、 表达量变化与否进行检测，主要用于感染性疾病病原体诊断、 先天遗传性疾病诊断、基因突变性疾病（如肿瘤）诊断、产 前诊断、亲子鉴定和法医物证等。基因诊断的内容主要有： （1）基因突变检测：如点突变、基因片段的缺失或插入、 基因重排等不同类型基因突变的检测。 （2）基因连锁分析：临床的一些疾病的致病基因尚不清 2 楚，很难用基因突变的检测诊断。因此对这些遗传疾病采用 基因连锁分析。 （3）基因表达分析：如 mRNA 定量检测及 mRNA 长度分 析等。mRNA 检测在基因表达水平上为基因功能是否正常提供 了直接依据。 （4）病原体诊断：即外来入侵病原微生物遗传物质的检 测。 二、基因诊断在诊断学中的位置 传统的疾病诊断方法主要是以疾病的表型改变为依据， 如症状、体征、物理检查、实验室检查，然而表型的改变在 许多情况下不是特异的，.同一种表型可能在多种疾病中出现， 而且表型往往在疾病发生一定时间后才出现，因此常不能及 时作出明确的诊断。研究发现各种表型的改变是由基因异常 造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因 诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状 时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及 某种疾病的易感者做出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病 家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指 导意义。 三、基因诊断的常用技术 分子生物学技术是基因诊断的主要技术。近年来随着分 子生物学技术日新月异，以核酸分子杂交和聚合酶链反应 3 （PCR）为核心发展起来了多种方法已被广泛用于基因诊断， 如 PCR 一单链构象多态性（ single strand conformation po1ymorphism，sscp）、限制性片段多态性（restriction fragment length po1ymorphism，RFLP）、等位基因特异性寡核苷酸分第 十章其他检测析（allele-specific o1igonucleotide，ASO）、基因 芯片技术（gene chip）、逆转录 PCR（re-verse transcription-PCR）、 Southern 印迹杂交（Southern blotting）、Northern 印迹杂交 （Northern blotting）、斑点杂交（dot blotting）和原位杂交（in situ hybridization，ISH）等。 （一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交是指两条互补单链核酸（DNA 或 RNA）在 一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程。它是研究 核酸结构与功能的常用技术。杂交的双方是探针与待检核酸， 杂交后形成的双链分子称为杂交分子（DNA-DNA、DNA-RNA 或 RNA-RNA）。分子杂交的方法多种多样，其共同点是：①应 用了核酸序列的复性原理；②都采用了标记探针。探针就是 同位素或非同位素（如：生物素或荧光染料等）标记的短片 段特异 DNA 或 RNA。常用的核酸分子杂交技术有： 1．Southern印迹杂交 Southern印迹杂交又称DNA印迹， 是英国科学家 Southern 于 1975 年发明的一种特定检测 DNA 片段的方法。其基本原理是：将基因组 DNA 用一种或几种限 制性内切酶消化成大小不同的片段，消化后用电泳的方法将 4 这些 DNA 按大小不同进行分离，分离后通过原位变性，将其 转印到固相支持物上，如：硝酸纤维素薄膜，再应用特异的 同位素或非同位素标记的 DNA 或 RNA 探针进行杂交，然后通 过对杂交信号的检测来确定探针互补条带的位置。基因的缺 失或突变可能导致带的缺失或位置改变。Southern 印迹的转 印方法有毛