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2013-2014分子生物学复习资料 一、中心法则 DNA RNA 蛋白质 二、DNA复制 (一) DNA复制的特点 1、半保留复制 DNA复制时分别以两条亲代链作为模板链通过酶催化各形成一条子代链，亲代链分开处即子代链合成处成为复制叉。 2、半不连续复制 DNA亲代链5’到3’方向的复制时，是以小片段的形式从5’到3’不连续的复制形成冈崎片段，再经DNA连接酶连接形成一条链。 3、RNA的引导 RNA的引导保证DNA复制的高忠实性。 （二） DNA复制所需要的酶 1、原核中： （１）DNA解旋酶：利用ATP水解的能量解开双链ＤＮＡ （２）DNA旋转酶（Ⅱ型拓扑异构酶）：引入负超螺旋从而释放正超螺旋。 （3）DNA聚合酶Ⅲ：延伸前导链和后随链中的引物。 （4）DNA聚合酶Ⅰ：切除引物。 （5）DNA连接酶：连接冈崎片段形成ＤＮＡ子代链。 2、真核中： （１）DNA聚合酶α：前导链和后随链的每个片段都是利用其引发酶活性从RNA引物开始。 （２）DNA聚合酶δ：在前导链上替代前一种酶继续延伸。 （３）DNA聚合酶ε：在后随链上完成DNA的复制。 （三） DNA聚合酶 1、真核中：真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发具5－3外切酶活性），β（定位于核内，参与修复，具5－3外切酶活性），γ（定位于线粒体，参与线粒体复制具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，参与复制，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位于核，参与损伤修复，具有3－5和5－3外切活性）。 2、原核中：原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。 功能 polⅠ polⅡ polⅢ 聚合作用5→3? ＋ ＋ ＋ 外切酶活性3→5? ＋ ＋ ＋ 内切酶活性5→3? ＋ － ＋ 焦磷酸解和焦磷酸交换作用 ＋ － ＋ 完整的DNA双链 － － － 带引物的长单链DNA ＋ － － 带缺口的双链DNA ＋ － － 双链而有间障的DNA ＋ ＋ ＋ 分子量（ｋｄ） 109 120 140 （四）DNA的损伤与修复 1、诱变 （1）突变 1) 点突变：一个单一碱基的改变 转换：嘌呤与嘌呤之间或是嘧啶与嘧啶之间 颠换：嘌呤与嘧啶之间或是嘧啶与嘌呤之间 2) 沉默突变：突变发生在ＤＮＡ的非编码区、非调节区或密码子的第三个碱基位置，不影响掺进蛋白质中的氨基酸 3) 错义突变：突变改变了基因产物的一个氨基酸 4) 移码突变：插入或缺失涉及一个或多个碱基的增加或丢失 （２）物理诱变：高能离子化辐射，如Ｘ射线、γ射线、紫外线（嘧啶二聚体是常见的一种产物） （３）化学诱变：碱基类似物（直接诱变）、亚硝酸、烷化剂等 ２、损伤 （１）氧化性损伤 （２）烷基化（如ＭＭＳ、ＥＮＵ） （３）聚化加合物 ３、修复 （１）光复活：在可见光下，ＤＮＡ光解酶可将环丁烷嘧啶二聚体再分解为单体 （２）烷基转移酶 （３）切除修复：核苷酸切除修复和碱基切除修复 （４）错配修复 （５）遗传性修复 （五）ＤＮＡ的克隆 １、ＤＮＡ的制备 （１）质粒DNA的制备 碱裂解法：从染色体ＤＮＡ及大部分其他细胞成分中纯化 酚抽提法：采用酚或酚－氯仿混合物进行抽提 乙醇沉淀： 氯化铯梯度法： （２）噬菌体DNA的制备 2、载体 （1）质粒载体 1) 插入失活原理：pBR322及其衍生物包含两个抗生素抗性基因，ampr和tetr，当目的基因插入其中一个时，会导致该基因失活。 2) 蓝白斑筛选：在质粒中含有LacZ基因（编码β-半乳糖苷酶，受Lac启动子的调控）的α-肽的序列，当无外源DNA片段插入时，质粒表达α-肽，它与宿主菌的Lac ZM15基因的产物互补，产生有活性的β-半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG存在的情况下，菌落呈蓝色（质粒自身环化）；外源基因插入后，肽基因阅读框架被破坏，细菌内无半乳糖苷酶活性存在，菌落呈白色（阳性克隆）。 （2）噬菌体载体 噬菌体颗粒将其线性DNA注入细胞，进而DNA连成环状，其后该DNA被复制组装成噬菌体颗粒，经裂解细胞释放到胞外，造成细胞死亡，或通过特异位点将其DNA整合到宿主基因组，而获得长期插入。 （3）其他载体 黏粒载体：利用λ噬菌体cos位点 YAC：酵母人工染色体 BAC：细菌人工染色体 （六）基因文库 1、基因组文库（DNA来自基因组DNA） 文库的大小，p代表给定概率，f是插入片段大小占总基因大小的比例。 2、cDNA文库（DNA来自群体mRNA的拷贝） cDNA第二条链的合成： a) 自身引物合成法：cDNA/mRNA杂合体用碱