2013-分子生物学实验.doc

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达 1. 构建重组质粒（ pET-28α-GFP）： 以特定的引物和模板，利用PCR获得gfP的片段 BamHⅠ.NdeⅠ酶切 回收 酶切片段 用同样的酶切DH5α（pET-28α）获得载体片段 连接酶切后回收的gfP片段和载体片段 获得重组质粒。 2. 导入与表达： 重组质粒 转化DH5α 酶切和PCR鉴定 电泳检测 质粒（pET-28α-GFP）转化BL-21（pET-28α-GFP） 诱导表达与检测 获得绿色荧光蛋白。 1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化（转化DH5α） 大肠杆菌感受态细胞的制备 1.接种：挑一大肠杆菌单菌DH5α（或BL21）落放入5mL LB液体培养基，37 ℃培养过夜。 2.转接活化大肠杆菌：取3mL新鲜的LB液体培养基加入50-150μL的过夜菌，培养2-3个小时，用处于对数生长期的菌液制备感受态细胞，此时OD600=0.2-0.4。(全班一起可以用锥形瓶活化培养后分装) 3.将活化的DH5α（或BL21）培养液在无菌条件下收集在一个5mL于eppendorf管中,冰上放置10 min,然后于4 ℃下 6000 rpm 离心5min； 4.在无菌条件下弃去上清, 转入到一个1.5mL eppendorf管中。用0.1 mol/L 的预冷的CaCl2溶液1mL轻轻悬浮细胞,冰上放置10 min, 4℃下6000 rpm 离心5 min； 5.加入100μL预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液缓和菌液，放置冰上。即成感受态细胞悬液（可-80 ℃长期保存）。 转化pET-28α-GFP 的连接产物（或者质粒） 1.取2个无菌离心管，分别加入100μL DH5α感受态细胞悬液，第1管加1μL无菌水（空白对照），第2管加入质粒DNA溶液1μL,轻轻摇匀,冰上放置30 min。 2.42 ℃水浴中热激90 s,热激后迅速置于冰上冷却2min。 3.分别向管中加入300μL LB液体培养基,混匀后在37 ℃100 r/min振荡培养45min。 4.从管1中取200μL涂布于含抗生素的平板上(空白对照),从管2中取200μL涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约40分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37 ℃培养20小时。 准备：无菌的eppendorf管，枪头，平板，培养基（倒平板时加抗生素kana），涂布棒 2 挑平板培养，kana抗性 用5mL 玻璃管培养 DH5α培养液 准备灭菌好的LB培养基（挑平板时要加抗生素Kana） 5ml加15μL 10mg/mL的卡那霉素（简称kana），那么终浓度（即工作浓度是30μg/mL） 3质粒DNA的提取分离与纯化 (碱法提取质粒) 1．将5mL DH5α培养液倒入 5mL的 eppendorf 管中, 9000 rpm离心5min。 2.弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3.菌体沉淀重悬浮于150μL预冷溶液Ⅰ中(需剧烈振荡混合均匀),冰浴放置3 min。 4.加入新配制的溶液Ⅱ300μL, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴3 min。 5.加入250μL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中3 min,12000 rpm离心5min。 6.取上清液500μL移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1) 500μL,缓和15 s, 12000 rpm离心5 min。 7.将水相移入干净eppendorf 管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于冰上10 min（或者放入冰箱冷冻层），然后12000 rpm离心10 min。 8 .弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入500 μL 70％乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，10000 rpm离心2 min。 9.吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥得质粒。加灭菌水20μL溶解质粒备用。 4质粒的限制性内切酶反应分析（酶切） 1.按下表加入其混合液 反应物（μL） pET-28α-GFP 质粒 Xho I XbaI 10×buffer ddH2O 5 0.3 0.3 1 3.4 2.离心5 s，混匀。 3.37 ℃水浴酶切3-4 h。 4.配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶15mL。 5. 适当放置冷却，45 ℃左右，加入2.5微升的Gelview核酸染料，混匀，倒于电泳胶板上，插好梳子。 6.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。 7.酶切样品中加入1μL溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。 8.1×TAE