E-D2AXXXX产品Protein A含量测定标准操作程序0507 4.doc

方法摘要： Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。因而，将Protein A?与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。XXXX产品是用Protein A柱纯化；本标准操作程序使用Enzo公司产的试剂盒，采用酶联免疫吸附法（ELISA）确定XXXX产品中的宿主Protein A残留量。 适用范围： 本标准操作程序适用于纯化中和纯化后的各中控样品和产品的Protein A残留分析。 职责： 操作人员： ? 严格按照此规程要求进行操作。 岗位主管： ? 起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新； ? 监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求； ? 培训，确保此操作规程的正确实施。 程序： 1 术语解释 无 2 仪器设备 2.1 移液管，200μL，1000μL；1200μL； 2.2 多通道移液器，300μL；1200μL； 2.3 单通道移液器，100μL；200μL；1000μL； 2.4 1.5ml EP管； 2.5 已包被鸡抗Protein A的抗体的微孔板条； 2.6 塑料密封膜（Enzo 30-0012） 2.7 震荡器（Heidolph，型号 TITRAMAX1000）； 2.8 漩涡混合器（XW-80A 上海精科实业） 2.9 Nano Photometer 核酸蛋白测定仪（P330 Implen 德国） 2.10 高速台式离心机（TGL-18B-C 上海安亭） 2.11 带有SOFTmax PRO5.3 数据分析软件的酶标仪（Molecμlar Devices，THERMOmax）。 3 试剂 3.1 Protein A ELISA试剂盒（Enzo，Cat.#：ADI-900-057）。 Protein A clear Microtiter Plate: Protein A 抗体包被96微孔板 80-0348 Assay Buffer 13 55ml 试验缓冲液 80-1500 Protein A Antibody 10ml 黄颜色Protein A 生物素标记抗体 80-0346 Protein A Conjugate 10ml Protein A 链酶亲和素 80-0347 Protein A Standard Protein A 标准品 浓度为10，000pg/ml 80-0621 Wash Buffer Concentrate 100ml 20x浓缩洗液 80-1287 TMB Substrate 10ml TMB 底物 80-0350 Stop Solution 2 10ml 终止液 10ml 80-0377 Protein A Assay Layout Sheet 1块 Protein A 试剂放置板 30-0100 Plate Sealer 2张 密封胶带 30-0012 3.2 1X洗液：用超纯水将20X洗液稀释到1X，用量根据实际需要配制。 4 实验程序 4.1 Protein A 标准品梯度稀释：取7个1.5 ml EP管，依次标记为1、2、3、…7；1号EP管中加入500μl Assay Buffer 13，2号到7号EP管中加入250μl Assay Buffer 13；取50μl 10 000 pg/ml标准品到1号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Standard 1（Std 1 1000 pg/ml）；吸取250μl1号EP管中的液体加入到2号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Standard 2（Std 2 500pg/ml）；以此类推即为Standard 4（Std 4 125 pg/ml）；Standard 5（Std 5 62.5 pg/ml）；Standard 6（Std 6 31.25 pg/ml）；Standard 7（Std 7 15.6 pg/ml）； 4.2 样品稀释：根据附件中样品稀释流程方法将样品稀释到2μg/ml，即Sample 1 (Sp 1 2 μg/ml)并标记为a号EP管；取3个1.5 ml EP管，依次标记为b、c、d；分别加入250μl Assay Buffer 13；吸取250μl Sample 1 到b号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Sample 2 (Sp 2)；吸取250μl b号EP管中的液体加入到c号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Sample 3 (Sp 3 )；吸取250μl c号EP管中的液体加入到d号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Sample 4 (Sp 4 )； 4.3 Protein A 标准品、样品预处理：将装有Protein A