分子生物学实验操作指南.doc

分子生物学大实验操作指南 单林娜 王莲哲 编 常用试剂的配制方法 （一）配方 1、1MTris-HCl, pH8.0, 500ml 60.55g Tris + 400ml H2O + 约26 ml 浓HCl 2、0.5 M Na2EDTA，pH8.0, 200ml （EDTA难溶于水，应优先配制，并加入适量NaOH助溶） 37.22g EDTA + 180ml H2O + 约8 g NaOH片（若是EDTA二钠盐可减半） 3、10% 葡萄糖 10g 葡萄糖 + 90ml H2O 4、1M NaOH：4g NaOH+ 96 ml H2O 5、KAc (3M K. 5M Ac) （9.814×3）g KAc + 30ml H2O + 11.5ml [60.5×2/1.049] 冰醋酸 + 28.5ml H2O——定容至100ml （溶液III: KAc 14.7g,HAC 5.8mL, 加水至50mL。乙酸；醋酸；冰醋酸 【英文名称】acetic acid 【结构或分子式】 CH3COOH 【相对分子量或原子量】60.05 【密度】1.049 醋酸钾(医药级) C2H3KO2 F.W. 98.14） 6、70% 乙醇 7、TE50ml ：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0，1 mmol/L EDTA，pH8.0 1MTris-HCl（pH8.0 ） 0.5ml 0.5 M Na2EDTA（pH8.0 ） 0.1ml H2O 49.4ml 8、CTAB抽提液100ml： 2%CTAB（十六烷基三乙基溴化铵） 100mmol/L Tris-HCl, pH8.0 / 1MTris-HCl（pH8.0 ） 10ml 20 mmol/L EDTA，pH8.0 / 0.5 M Na2EDTA（pH8.0 ） 4ml 1.4mol/L NaCl (8.18g) （二）操作步骤 1、刷洗试剂瓶等玻璃器皿 清水——去污粉——清水4遍——蒸馏水2遍 2、按配方配制试剂 计算用量写出配方——称量（学习掌握电子天平用法）——混溶 3、灭菌（复习巩固压力锅用法） 实验一 总DNA提取（4学时） （一）总DNA提取 1．目的：学会提取纯化DNA的试剂的配法，学会使用离心机、移液器，掌握总DNA 的提取和纯化技术。 2．实验原理： 在SDS或 CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取DNA。 CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。 提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNase。 3．实验器材和试剂 试材：刺蛾蛹 仪器、用具：离心机、离心管、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩等。 4．实验准备： 需配置的药品和缓冲液： 提取DNA缓冲液（CTAB法）: 2% CTAB(W/V),100 mmol/L Tris-HCI pH 8.0, 20 mmol/L EDTA pH 8.0, 1.4 mol·L-1 NaCl，2% PVP (灭菌后加入2% PVP ，使之充分溶解）。在研磨叶片前加入1%（V/V）?-巯基乙醇。 TE(pH 8.0): 称取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ，先用800 mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH 8.0，再用蒸馏水定容至1000 mL。高压灭菌20 min。 氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。 酚 : 氯仿 : 异戊醇(25:24:1)：按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。 5．操作步骤： （1）将单头蛹放入1.5ml 离心管中，加入足量液氮充分研磨； （2）吸取500μl 65℃预热的2×CATB缓冲液[0.1M Tris-HCl(PH 8)，1.4MNaCl，0.02MEDTA，2%CTAB,0.2%α-巯基乙醇]，注入管中少许，继续研磨后，将余液全部注入； （3）匀浆物置于65℃孵育45~60min，中途混匀数次； （4）短暂离心，将上清液转至一只新管，沉淀用200μl 2×CATB再悬浮，孵育20~30min后离心； （5）将