分子生物学用电泳技术.doc

概 述 　　电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质。当蛋白质溶液的pH在蛋白质等电点的碱侧时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动。只有蛋白质溶液pH在蛋白质的等电点时静电荷是零，在电场中不向任何一极移动。 　　电泳现象早在1890年就被发现，1907年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素；1937年由Tiselius制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认 识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂。价格昂贵难于普及。1940年左右。以纸为支持物的电泳问世后，电泳技术得到迅速发展。 　　电泳技术以支持物分，可分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼 脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱 状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。 ???? 类 ? 别 ?????????????????? 名? ?称 用支持体的电泳技术 1.纸上电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.薄层电泳 4.非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)5.凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂（糖）凝胶 不用支持体的电泳技术 1.Tiselius或微量电泳2.显微电泳 3.等电点聚焦电泳技术4.等速电泳技术5.密度梯度电泳 　　各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白；用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料；用高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构；用高压电泳和层析结 合研究核酸的一级结构。凝胶电泳技术在分离分析酶。蛋白质，核酸等生物大分子方 面具有较高的分辩力，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。 　 ?影响电泳的因素 　　不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度（或迁移率）来表 示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳的速度。影响泳动度的主要因素有： 1、首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。 　　一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反 之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电 荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有 相反电荷的离子吸引在其周围，形成一离子扩散层。加以电场时，颗粒向符号相反的 电极移动即带阳电荷颗粒移向负极，带阴电荷颗粒移向正移；离子扩散层由于带有过 剩的与颗粒符号相反的电荷，可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电 引力使颗粒的泳动度减慢，另外，高分了颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗 粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。 2、电场强度 　　电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对 泳动度起着十分重要的作用。例如纸电泳。测量25厘米长纸条两端电压为250伏特， 则电场强度为250伏特/25厘米=10伏特/厘米。 　　一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分 为常压电泳和高压电泳，前者的电压在100-500伏特，电场强度一般是2-10伏特/厘 米；后者电压可高达500-1000伏特，电场强度在200-2000伏特/厘米。常压电泳分离 时间需数小时至数天，高压电泳时间短，有时仅几分钟即可，高压电泳主要用于分离 氨基酸，肽，核苷酸，由于电压升高，电压也随之增大，故需冷却装置。 3、溶液的pH值 　　溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于 蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离电点越远，颗粒所带净电荷越多；电 泳速度越快；反之则越慢。例如血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白等 电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5.1，γ球蛋白等电点是7.1。 当在pH8.6的电泳缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度是白蛋 白 α2球蛋白β球蛋白γ球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择 一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。同 时，为保持电泳过程中溶液pH恒定也须使用缓冲液。 4、溶液的离子强度 　　溶液的离子强度是另一个重要选择的条件，在保持足够缓冲能力前提下，离子强 度要最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常缓冲液离 子强度选择在0.05 - 0.1M之间。浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。如果这种额外的热可以驱散， 高浓度的缓冲液扩散常数较低，可以产生较窄