酵母实验文献_实验全过程1讲述.pptx

实验全过程 张宇 载体 LB 提质粒 酶切 T4酶连接 筛选 重组子 酵母 感受态细胞 酵母转化 筛选 培养 酿酒酵母电击转化感受态细胞的制备（Thompson，1998） 1. 从YPD平板上培养的酵母菌落中挑取单菌斑，接种于10mL YPD 液体培养基中，30℃下180rpm 振荡培养18—24h。 2. 取1mL 过夜培养菌液接种于50mL新鲜的YPD液体培养基中， 30℃下180rpm振荡培养8—10h至OD600 ≈ 0.30—0.35 3. 取出，于冰上放置15min使细胞停止生长；将菌液转至无菌的50mL离心管中， 4℃,3000rpm 离心5min，去上清，收集酵母细胞。 4. 加入50mL无菌水，重悬菌体，4℃,3000rpm 下离心5min，去上清。 5. 8mL无菌水重悬菌体，加入10mL 10XTE 缓冲液，摇匀后，再加入10mL 10XLiAC缓 冲液，摇匀后，30℃下180rpm振荡培养45min。 6. 加入1M的DTT至浓度为25mM：混合均匀后30℃下180rpm振荡培养15min。 7. 将酵母菌悬液稀释在50mL的ddH2O中，4℃下3000rpm 离心5min，去上清。 8. 依次重悬细胞，前两次里悬后下4℃下3000rpm 离心5min，去上淸，所用溶液如下： 第一次重悬：25mL冰冷的ddH2O 第二次重悬：2—5mL冰冷的1M山梨醇 第三次重悬：1mL冰冷的1M山梨醇 *每次重悬后，应剧烈吹打细胞沉淀，使得细胞能够完全分散幵，最后重悬酵母菌体积 应在1.0—1.5mL之间。 （选自 共表达_1_3_1_4_葡聚糖酶_省略_酿酒酵母的构建及其性能的应用研 究_鲁健章 浙江大学 博士学位 论文 P60） 酵母感受态制备 1. 将活化的NY—K菌株从平板上接入5mLYPD 液体培养基中，250rpm 30℃过 夜培养。 2. 以0.5%接种量转接至200mL YPD培养基中（为了保证足够的氧气供应，使 用1L 的三角瓶） 摇瓶过夜至1.0—1.3。 3. 3000rpm 4℃下，离心5min，离心，收集细胞沉淀，重悬于200mL冰冷的无菌水。 4. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于100mL冰冷的无菌水。 5. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于8mL冰冷的1mol/L山 梨醇溶液。 6. 3000rpm 4℃下，离心5min，收集细胞沉淀，重悬于1mL冰冷的1mol/L山梨醇溶液。分装，80μl管，即为感受态细胞。-80℃存。 (选自 多基因转化构建重组工业酿酒酵母及其在木薯酒精发酵中的应用研究_阳辛凤 海南大学 博士论文 P44) 酵母YPH501感受态细胞的制备 1. 挑取YPH501单菌落,30℃振荡培养过夜 2. 取过夜培养的菌液1%接种于40mL LB液体培养基中,30℃震荡培 养至OD600约为0.6。 3. 菌液转移至离心管,离心,3600r/min离心6min，弃上清 4. 加入40mL 1xTE ,小心重悬沉淀,3600r/min离心6min,弃上清 5. 加入20mL 1xTE ,小心重悬沉淀,3600r/min离心6min,弃上清 6. 加入2mL 1xLi Ac/0.5 xTE ,室温放置10min。 7. 将感受态细胞分装于预冷的无菌离心管中(200μL 每管),-70℃保 存 （选自 青蒿素前体合成酵母工程菌构建及发酵产物生物转化研究_曾丽香 广州中医药大学 硕士论文 P33） 酵母菌完整细胞转化法 1. 将受体菌接种于 YEPD 斜面培养基活化一次 2. 从活化的斜面上取一环菌体接种于 2m L YEPD 液体培养基中，28℃振荡培养至对数期 （约 12～16h） 3. 4000g 离心 30 秒收集菌体，用 TE 洗一次 4. 用 0.1mol/L Li Ac-0.01mol/L TE 溶液悬浮菌体，加入 10μg 小牛胸腺 DNA，0.01μg 质粒 DNA，700μL PEG4000 溶液，充分混匀后于 28℃保温处理 1h； 5. 42℃热冲击处理 25min; 6. 待转化液温度降至室温后，取 200μL 转化液与 15m L 保温在 45～48℃的选择培养基混合 后倒平板，28℃培养 3～4d 长出转化子。 （选自酒酒球菌mleA和mleP基因的克隆及其在酿酒酵母中的转化与表达_刘延琳 西北农林科技大学 博士论文 P6