酶组织化学-刘学光讲述.ppt

酶组织化学 刘学光 复旦大学基础医学院病理学系 glxg69@shmu.edu.cn 酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质 一般催化剂的共性： 1. 用量少而催化效率高 2. 不改变化学反应的平衡点 3. 可降低反应的活化能 作为生物催化剂的特性： 1. 催化效率高： 比其他催化反应高107-1013倍 2. 高度专一性 3. 易失活 4. 酶活力受调节控制 5. 酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关 酶的分类、命名 1.习惯命名法：底物，所催化的反应性质，来源，其他特点 2.国际系统命名法：酶的底物 + 催化反应的性质 3.主要分类：催化反应的性质，六个大类 （1）氧化还原酶:氧化还原反应 （2）移换酶：功能基团的转移反应 （3）水解酶：水解反应 （4）裂合酶：从底物上移去一个基团而形成双键，或其逆反应 （5）异构酶：同分异构体的相互转变 （6）合成酶：连接酶 催化一切必须与ATP分解相偶联且由两种物质（双分子）合成一种物质的反应 酶组织化学( Enzyme Histochemistry) 通过细胞内固有的酶催化底物的作用，并借助显色反应，在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及定位。 特点 （1）原位检测：组织定位 （2）显示酶活性 发展历史 Klebs(1868)年Struve(1872)证明中性多核白细胞过氧化酶存在 1939年前，研究细胞内的氧化反应 1939年，Takamatsu、Gomori 碱性磷酸酶（硫化钴反应 、银反应） 随后：磷酰胺酶、 ATP酶、 脂酶、酯酶等 金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法，磷酸化酶组织化学证明法…… 电镜酶组织化学：酶更精准的定位 1955年 Scheldon、 Brandes 金属沉淀法 1967年 Seligman 锇黑化法 免疫组织化学：抗原抗体反应+酶反应 1970年 Sternberger 酶标抗体法 基础知识 （一）细胞内的酶的特性 * 水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂 * 有机溶剂不同程度降低酶的活性 * 易受温度影响，对热耐受性弱 * 对干燥耐受性强 （二）酶的定位 在细胞内或超微结构中存在于特定部位 浆膜 — 5’-核苷酸酶 细胞膜— ATPase 线粒体 …… 1. 酶促反应 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物，即：初反应物(primary reaction product, PRP)。 2. 显色反应 其中之一再与辅助物经一步或二步反应，生成有色不溶水的终反应物(final reaction product, FRP) 沉积在原位以显示酶的存在和活性大小。 酶组织化学的基本原理 Artifact — PRP弥散 → 定位不准确 受3个因素影响： 1. 底物在酶催化下水解的速度 — 快 2. PRP在缓冲液中的弥散系数 — 小 3. PRP与辅助物反应的速度 — 快 辅助物浓度一般≦1 mg/ml 一般原则 最大限度保存酶活性、防止弥散、保证反应产物的特异性 1. 标本处理及制片不能影响酶活性和分布 2. 底物对酶有特异性：酶抑制剂/激动剂检测特异性 3. 底物和辅助试剂渗透好：迅速，同步 4. 辅助试剂不能影响酶活性和其它反应剂的渗透 5. PRP与辅助试剂反应要快 FRP必需是水不溶、有色且稳定的物质 6. 所有试剂不能与组织细胞有非特异性的吸附 主要步骤 1.组织处理：不固定（冷冻切片，新鲜） 固 定（特殊固定剂，低温包埋） 2.孵育 3.显色 4.显微镜下观察 各步骤需要注意的问题： 1. 组织处理：“最大限度保存酶活性” 最常用：新鲜组织，快速冷冻，冰冻切片 长期保存需密封，-70℃ 丙酮固定，低温脱水、包埋（eg. γ-谷氨酰转肽酶） 常规方法（极少数酶类：氯乙酸酯酶） 染色前的预固定 — 保持组