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酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISA） ——双抗体夹心法 免疫学三大标记技术 荧光标记技术 酶标记技术：酶联免疫吸附试验（ELISA） 放射性同位素标记技术：放射免疫 ELISA 的发展历程 免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术 1966年，Nakane和Avrameas等分别报道用酶代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术（enzyme-labelled antibody technique），用于生物组织中抗原的定位和鉴定。 1971年，Engvall ，Van Weemen 等报道了酶联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技术。 20世纪80年代，酶标记抗体检测和鉴定蛋白质分子的免疫转印技术问世， 目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。 酶联免疫吸附试验（ELISA） 原理： 酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种固相酶免疫测定的方法，目前广泛应用于各种抗原和抗体的检测。其基本原理是将抗原或抗体固定在固相载体表面，并保持其免疫活性，再与酶标记抗体或抗原联结，并保留酶的活性，然后加入酶反应的底物，后者被酶催化变为有色产物，反应颜色的深浅可与相应抗原或抗体的量相关 ELISA反应类型 直接法（双抗体夹心法）：测抗原。 间接法：测抗体 竞争法： 桥联法（ABC－ELISA）：应用亲和素（Avidin）和生物素（Biotin）的ELISA 双位点一步法：针对抗原分子上两个不同抗原决定簇测定抗原。 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。 3.再加入以辣根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合，形成抗 体-抗原-酶标记抗体复合物。 4.标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，指示特异性抗原 抗体反应的存在。在一定范围内显色深浅与抗原量成正比 双抗体夹心法示意图 酶 抗体 酶标记 抗体 固相载体 1.将抗原包被在固相载体上 2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。 。 间接法示意图 1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合为抗原抗体复合物。 3.同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合为酶标记抗原-抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。 酶标抗原竞争法示意图 双抗体夹心法 1.用已知抗体包被固相载体 2.加入受检的标本（含待测抗原），使抗原与固相上的抗体结合 3.加入以辣根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合。标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，指示特异性抗原抗体反应的存在。在一定范围内显色深浅与抗原量成正比 桥联法（ABC－ELISA）： 操作步骤 1、装板条（勿摸孔底、注意方向） 2、加抗原（勿刮孔底、勿打出太多气泡） 3、孵育 37℃ 30min（全班同步） 4、甩去孔内液体， 洗涤3次：洗涤液加满、略震晃、甩去、拍干 （注意团队合作） 5、加抗体，每孔100ul 6、孵育 37℃ 30min（全班同步） 7、重复第4步，但洗4次 8、加底物A和B各100ul，略震晃混匀 9、孵育 37℃ （全班同步）10min左右，待色变蓝 10、加终止液50ul，略震晃混匀 11、酶标仪测OD 12、画标准曲线，确定样本浓度 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ag稀释液（ul） 100 100 100 100 100 100 Ag (400ug/ul) 0 100 100 标本1 100 100 标本2 100 100 Ag浓度 0 12.5 25 50 100 200 400 待测 待测 待测 待测 取已包被抗体的酶标板，分别在第1-6孔各加入抗原稀释液100 ul，第6、7孔各加入400μg/L抗原溶液100 ul，从第6-2孔进行对倍稀释（最后在第2孔吸出的100 ul弃去）；在第8、9孔各加入100 ul待测标本1；在第10、11孔各加入100 ul待测标本 稀释方法 操作注意事项 正确掌握微量移液器的使用方法：吸液时将按钮按至第一止点，排液时则应尽力按足按钮（至第二止点）。 酶标板的正确洗涤：加洗涤液时应小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中，造成交叉污染。洗涤后应尽量甩干孔内残液。洗涤液加入孔后，须保持三分钟再弃去。 注意加样顺序，加样品时应注意从最高稀释度逐一加至最低稀释度。 ELISA技术要点 固相载体： 良好的ELISA板应