高效液相色谱法正式版讲述.pptx

第 16 章 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 16-1 概述 16-1-1 高效液相色谱法 高效液相色谱法（HPLC）又称高压液相色谱法或高速液相色谱法，是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种以液体做流动相的新的柱色谱技术。 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备分离效率高、检出限低、灵敏度高、分析速度快、操作自动化的特点。目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 16-1-2 液相色谱分离原理及分类 1.液相色谱分离原理： 液相色谱的分离系统也由两相-固定相和流动相组成。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱中。根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 2.色谱分离的实质 色谱分离的实质是样品分子与溶剂（流动相或洗脱液）及固定相分子间的作用力，作用力的大小决定色谱过程的分离（保留）行为。 2.液相色谱的分类 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 体积排阻色谱法 亲和色谱 依据样品组分在固定相上的吸附性能差异实现分离的。 依据样品组分在流动相和固定相之间的分配性能差异实现分离的。 依据样品中离子与固定相上的电荷基团进行可逆性离子交换的能力的差异实现分离的。 依据样品组分的分子尺寸不同实现分离的。 主要用于生化分析，固定相含有能与生物分子可逆结合以及解离的配基（配体），如生物分子（抗原）与配体（抗体）之间的特异性相互作用不同而实现分离的。 1.高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 ①经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1~3cm，固定相粒径100μm 且不均匀， 常压输送流动相 ，柱效低（H↑，n↓） 分析周期长，无法在线检测。 ②HPLC：分离和分析， 柱内径2~6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱） ，高压输送流动相，柱效高（H↓，n↑），分析时间大大缩短，可以在线检测。 16-1-3 液相色谱与经典液相色谱、气相色谱的比较 2.高效液相色谱法与气相色谱法的比较 ①LC 和 GC 的共性 色谱基本概念与术语、色谱基本理论、基本关系式及定性定量方法对于高效液相色谱同样适用。 影响柱效的因素同样为涡流扩散、分子扩散及传质阻力三项。 ② 两者具有很大的互补性 互补性：低沸点—高沸点。 ③ 两者的差异 a. 分析对象（两者应用范围不同） GC: 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，对高沸点，热不稳定，离子型化合物及高聚物的分离分析较困难。20%有机物能采用气相色谱分析。 HPLC：溶解后能制成溶液的样品； 不受样品挥发性和热稳定性的限制 ，分子量大、难气化、不易挥发或热稳定性差、高分子及离子型样品均可检测 ； 用途广泛，有机物的80%能采用HPLC进行分析。 b.流动相差别 GC：流动相为惰性气体，气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力，组分只与固定相作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用，流动相种类较多，选择余地广。 c.操作条件差别 d.制备分离 LC在制备分离上，有很广泛的应用。但高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，而且缺乏通用的检测器，这是它的主要缺点。 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 3. 液相色谱柱效 Giddings 提出的液相色谱速率方程如下： H=He+Hd+Hs+Hm+Hsm H为塔板高度；He，Hd，Hs，Hm，Hsm 分别为涡流扩散项、纵向扩散项、 固定相传质阻力、 流动相传质阻力、 滞留流动相传质阻力。 （1）He=2λdp , λ载体颗粒的不规则因子， dp 载体粒径。 采用小粒 度载体颗粒和提高柱内载体填充的均匀度可以提高柱效。 （2）Hd=CdDm/u, u为流动相线速度，Cd 为常数，Dm为组分在流动相 中的扩散系数。液体黏度比气体大得多，且液相色谱柱温较低，接近 室温，因此组分在液体中的扩散系数 Dm 较小，而当 u大于1cm/s时， Hd可以忽略。 （3）Hs=Cs’df 2 u/Ds , Cs’与分配比k’有关的系数，df 为固定液液膜厚 度，Ds为组分在固定液中的扩散系数，因此，可以通过改善传质过程 ，加快组分分子在固定相上的解吸过程来提高柱效。对液液分配色谱 ，可以使用较薄的固定相层；对于化学键合相，此项可忽略；对吸附 、排阻与离子交换色谱可以使用较小颗粒的填